[發明專利]一種單皰病毒潛伏感染細胞模型的建立及活化方法

無效

• 申請號: 201310574457.9
• 申請日: 2013-11-17
• 公開（公告）號: CN103667175A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 趙格;陳豪;袁青;謝立信
• 申請（專利權）人: 山東省眼科研究所
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12R1/93
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

技術領域

本發明屬于生物模型構建技術領域，具體涉及一種單皰病毒潛伏感染細胞模型的建立及活化方法，即用單純皰疹病毒I型(HSV-1)體外靜止感染原代兔角膜基質細胞來模擬潛伏期單皰病毒性角膜炎的細胞模型。

背景技術

單純皰疹病毒I型(HSV-1)感染角膜所致的單皰病毒性角膜炎是一種嚴重的致盲性眼病，臨床上尤以基質型最為常見。HSV-1的原發感染通常是無明顯癥狀的，但病毒從此可在宿主體內潛伏。最近的研究表明在92%的正常人中可以通過PCR檢測到HSV-1的DNA。HSV-1復發感染可以引起眼部病變，反復復發還可以引起角膜瘢痕形成、新生血管化，甚至失明。在美國，每年大約有59萬的新發病例，其中25-42%的病人初發1-2年間又復發；而在我國城市盲目的調查中，角膜致盲占第二位，其中HSK引起的占角膜盲的首位（42.5%）。目前對于HSK還沒有根治的藥物或手術治療方法，最終需要進行角膜移植治療，這也是HSK在美國成為穿透性角膜移植手術數目第三位的主要原因。研究表明HSK難以治愈的主要原因是HSV-1可以在宿主體內建立潛伏，并反復復發，而對于潛伏建立、維持和復發的具體機制還并不清楚，故加強對本病潛伏、復發機制和臨床對策的研究，已成為眼科亟待解決的課題。

HSV-1具有嗜神經特性，三叉神經節是國內外公認的HSV-1在體內的潛伏部位，但更多的實驗證據和臨床現象表明角膜是HSV-1在體內潛伏的又一部位。HSV-1能夠在三叉神經節內潛伏感染是由病毒抗原、神經細胞及宿主免疫反應三者共同作用的結果，然而對于HSV-1在三叉神經節內潛伏的純基礎研究成果并未對解決單皰病毒性角膜炎反復發作提出建設性意見。越來越多的研究表明HSV-1也能夠在角膜內潛伏，但目前僅限于在潛伏期宿主角膜內可以檢測到病毒核酸或抗原，而對于HSV-1角膜內潛伏復發的機理還未有研究。

要研究HSV-1在角膜內潛伏復發的機理，那么建立HSV-1在角膜內潛伏復發的模型就很有必要。體內的動物模型目前已經在兔和小鼠角膜內成功建立，其方法就是HSV-1感染劃傷的角膜，經過炎癥較為嚴重的急性感染期后，角膜慢慢恢復透明，感染1-2個月后，HSV-1進入潛伏感染，然后利用250-300mJ/cm²強度的UV-B照射角膜，潛伏的HSV-1就可以活化，再次引發角膜炎。然而體內潛伏復發的模型并不十分穩定，動物間個體差異往往較大；每次的研究都需要一批的動物，造價往往較大；而且前后需要的時間也比較長；體內模型對于機理的研究并沒有細胞模型那么方便。因此很有必要建立一種HSV-1在角膜細胞內潛伏感染的體外模型的方法，從而更方便準確的研究單皰病毒性角膜炎潛伏復發的機理，以及探討并評價抑制其反復復發的藥物。而目前為止，尚未見到有HSV-1在角膜細胞內建立體外靜止感染并活化的模型報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種建立單純皰疹病毒I型體外靜止感染原代兔角膜基質細胞模型的方法，以便更準確、快速、經濟的研究單皰病毒性角膜炎潛伏復發的機理，并進一步尋找抑制其反復復發的藥物，從而彌補現有技術的不足。

本發明的方法，包括如下的步驟：

1）原代兔角膜基質細胞的培養

將去掉內皮的兔角膜酶解消化處理后，去掉上皮層并剪成小塊，放入細胞培養液中進行培養，培養結束后，將培養的原代角膜基質細胞經細胞消化液消化后用于后續的細胞誘導分化；

其中所述的酶解消化，是將角膜放入Dispase酶中，4℃孵育過夜；然后放入37℃繼續消化30分鐘；

所述的細胞培養液的組成為DMEM-F12，且添加了10%（v/v）的FBS、終濃度為100U/mL青霉素和0.1mg/mL的鏈霉素；細胞經消化液為添加有0.25%（w/v）胰酶的0.02%（w/v）EDTA溶液。

2）原代兔角膜基質細胞的神經潛質誘導

將步驟1）制備的兔角膜基質細胞先用細胞培養液培養至細胞長至單層，然后換細胞誘導分化液對角膜基質細胞進行神經潛質誘導分化，37℃條件下誘導分化7-10天，3-4天換液一次；

所述的細胞誘導分化液為DMEM-F12，且添加有1%（w/v）BSA，50ng/mL注射用鼠神經生長因子NGF，青鏈霉素雙抗（終濃度分別為100U/mL和0.1mg/mL）

3）HSV-1靜止感染誘導原代兔角膜基質細胞