[發(fā)明專利]一種單皰病毒潛伏感染細(xì)胞模型的建立及活化方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310574457.9
• 申請日: 2013-11-17
• 公開（公告）號: CN103667175A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙格;陳豪;袁青;謝立信
• 申請（專利權(quán)）人: 山東省眼科研究所
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12R1/93
• 代理公司: 青島海昊知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

1.一種單皰病毒潛伏感染細(xì)胞模型的建立方法，包括如下的步驟：

1）原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)

將去掉內(nèi)皮的兔角膜酶解消化處理后，去掉上皮層并剪成小塊，放入細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)的原代角膜基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞消化液消化后用于后續(xù)的細(xì)胞誘導(dǎo)分化；

2）原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)潛質(zhì)誘導(dǎo)

將步驟1）制備的兔角膜基質(zhì)細(xì)胞先用細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)至細(xì)胞長至單層，然后換細(xì)胞誘導(dǎo)分化液對角膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)潛質(zhì)誘導(dǎo)分化，37℃條件下誘導(dǎo)分化7-10天，3-4天換液一次；

3）HSV-1靜止感染誘導(dǎo)原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞

HSV-1靜止感染角膜基質(zhì)細(xì)胞前一天，將細(xì)胞誘導(dǎo)分化液換成靜止感染維持液，37℃孵育24hrs，然后加入0.1-1MOI的HSV-1，37℃感染過夜；吸棄HSV-1后加入新的靜止感染維持液繼續(xù)培養(yǎng)9天完成細(xì)胞模型建立。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的1）中的酶解消化，是將角膜放入Dispase酶中，4℃孵育過夜；然后放入37℃繼續(xù)消化30分鐘完成的。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的1）中的細(xì)胞培養(yǎng)液的組成為DMEM-F12，且添加了10%（v/v）的FBS、終濃度為100U/mL青霉素和0.1mg/mL的鏈霉素；細(xì)胞經(jīng)消化液為添加有0.25%（w/v）胰酶的0.02%（w/v）EDTA溶液。

4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的2）中細(xì)胞誘導(dǎo)分化液為DMEM-F12，且添加有1%（w/v）BSA，50ng/mL注射用鼠神經(jīng)生長因子NGF，終濃度分別為100U/mL和0.1mg/mL的青霉素和鏈霉素。

5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的2）中的細(xì)胞誘導(dǎo)分化液為DMEM-F12，且添加有1%（w/v）BSA，50ng/mL注射用鼠神經(jīng)生長因子NGF，終濃度分別為100U/mL和0.1mg/mL的青霉素和鏈霉素。

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的2）中的靜止感染維持液為DMEM-F12，且加入1%BSA，50ng/mL注射用鼠神經(jīng)生長因子NGF，100μM阿昔洛韋ACV，終濃度分別為100U/mL和0.1mg/mL的青霉素和鏈霉素。

7.一種單皰病毒潛伏感染細(xì)胞模型；其特征在于，所述的模型是由權(quán)利要求1所述的方法構(gòu)建的。

8.權(quán)利要求7所述模型的活化方法，其特征在于，是向細(xì)胞模型中加入病毒激活因子Forskolin在37℃孵育完成活化。