[發(fā)明專利]miR-218模擬物、其應(yīng)用以及一種篩選能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲藥物的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310567075.3
• 申請(qǐng)日: 2013-11-14
• 公開（公告）號(hào): CN103740809A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 金衛(wèi)林;高興春;涂艷陽;崔大祥
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 上海旭誠知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種miRNA的應(yīng)用。?

背景技術(shù)

膠質(zhì)瘤是臨床上最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，約占所有原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤的45%左右。按膠質(zhì)瘤的惡性程度分為I－IV級(jí)，級(jí)別愈高，其惡性程度愈大。在所有膠質(zhì)瘤病人中，25%～50%的為II級(jí)；50%～75%的為III級(jí)；75%～100%為IV級(jí)。惡性度高者瘤內(nèi)常有壞死與出血，血管豐富，血管外層及內(nèi)皮細(xì)胞均有明顯增生，除手術(shù)切除外，膠質(zhì)瘤的藥物療效和放療效果都不甚理想，因此膠質(zhì)瘤是療效最差的惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，膠質(zhì)瘤病人的一年總生存率低于30%，級(jí)別高的病人中位生存期只有大概15個(gè)月。膠質(zhì)瘤預(yù)后差的一個(gè)主要原因?yàn)槟z質(zhì)瘤的高度侵襲能力，惡性程度高的膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長，腫瘤成份與正常腦組織的分界模糊，手術(shù)往往不能將腫瘤組織完整切除，術(shù)后膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)率較高。復(fù)發(fā)的膠質(zhì)瘤中，超過90%起源于手術(shù)區(qū)的浸潤瘤細(xì)胞或手術(shù)區(qū)邊緣的癌細(xì)胞。理解膠質(zhì)瘤的遷移機(jī)制，尋找和發(fā)現(xiàn)新的膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)的基因和信號(hào)途徑對(duì)于膠質(zhì)瘤的分子干預(yù)具有重要的意義。?

原癌基因Bmi1（B-cell-specific?Moloney?murine?leukemia?virus?insertion?site1）是在1991年首次被報(bào)道，屬于多梳基因家族（Polycomb?Group?genes，PcG）成員，是與細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換和細(xì)胞增殖相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄抑制因子，直接參與細(xì)胞生長、增殖的調(diào)節(jié)，Bmi1基因在多種惡性腫瘤如膠質(zhì)瘤、肺癌、白血病、前列腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等中大量表達(dá)，并且與這些腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、預(yù)后密切相關(guān)。INK4a/ARF是Bmi1基因調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和老化的靶點(diǎn)，在Bmi1缺陷的小鼠成纖維細(xì)胞（MEF）和淋巴細(xì)胞中，INK4a/ARF表達(dá)水平明顯升高，相反，Bmi1過度表達(dá)的MEF細(xì)胞中INK4a/ARF蛋白下調(diào)，細(xì)胞可發(fā)生永生化，所以Bmi1通過抑制INK4a/ARF基因的表達(dá)來維持細(xì)胞的自我更新。Bmi1在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)，并且敲除Bmi1的膠質(zhì)瘤細(xì)胞在體成瘤能力減弱。?

MicroRNA（miR，也稱miRNA）是一類長度為20-25核苷酸的非編碼的單鏈RNA，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個(gè)核苷酸大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成，通過與mRNA互補(bǔ)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)，?參與調(diào)控心臟疾病、血管疾病、神經(jīng)和腫瘤等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。腫瘤的侵襲性是區(qū)別惡性腫瘤和良性腫瘤的重要生物學(xué)特征，也是目前惡性腫瘤難以治愈最終導(dǎo)致死亡的重要原因，因此研究腫瘤侵襲的調(diào)控機(jī)制一直是腫瘤領(lǐng)域的主要方向。但是腫瘤的侵襲是一個(gè)多基因參與的復(fù)雜調(diào)控過程，所以能夠同時(shí)調(diào)控多個(gè)靶基因表達(dá)的mircoRNA自從發(fā)現(xiàn)之日起就成為了腫瘤發(fā)生和侵襲過程中研究熱點(diǎn)。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲藥物的篩選方法，該方法工藝簡(jiǎn)單，成本低，應(yīng)用該方法成功篩選并驗(yàn)證了miR-218模擬物具有抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的效果，從而達(dá)到抑制膠質(zhì)瘤的目的。?

本發(fā)明的第一方面，涉及一種RNA分子miR-218模擬物，其堿基序列包含miR-218核酸序列“莖-環(huán)”結(jié)構(gòu)的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，主序列如下：5’-UUGUGCUUGAUCUAACCAUGU-3’（SEQ?ID?NO.3）。?

本發(fā)明的第二方面，涉及根據(jù)本發(fā)明第一方面的RNA分子miR-218模擬物在抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲藥物中的應(yīng)用。?

本發(fā)明的第三方面，涉及一種篩選能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲藥物的方法，其中所述藥物為miRNA或其模擬物，步驟包括：?

（1）利用定量PCR法檢測(cè)待篩選藥物對(duì)Bmi1轉(zhuǎn)錄水平的抑制作用；?

將待篩選藥物轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞后利用trizol法提取總RNA，消化DNA后，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，定量PCR法檢測(cè)Bmi1轉(zhuǎn)錄水平。?

擴(kuò)增Bmi1的引物如下：?

Bmi1基因上游引物Bmi1-F：GCTTCAAGATGGCCGCTTG（SEQ?ID?NO.1），?

Bmi1基因下游引物Bmi1-R：TTCTCGTTGTTCGATGCATTTC（SEQ?ID?NO.2）；?

（2）利用劃痕法對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移進(jìn)行檢測(cè)；?

（3）利用transwell法對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲進(jìn)行檢測(cè)。?