[發明專利]miR-218模擬物、其應用以及一種篩選能夠抑制膠質瘤細胞遷移和侵襲藥物的方法

無效

• 申請號: 201310567075.3
• 申請日: 2013-11-14
• 公開（公告）號: CN103740809A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發明（設計）人: 金衛林;高興春;涂艷陽;崔大祥
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 上海旭誠知識產權代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

1.一種RNA分子miR-218模擬物，其堿基序列包含如下序列：5’-UUGUGCUUGAUCUAACCAUGU-3’。

2.如權利要求1所述的RNA分子miR-218模擬物在抑制膠質瘤細胞遷移和侵襲藥物中的應用。

3.一種篩選能夠抑制膠質瘤細胞遷移和侵襲藥物的方法，其中所述藥物為miRNA或其模擬物，步驟包括：

（1）利用定量PCR法檢測待篩選藥物對Bmi1轉錄水平的抑制作用；

將待篩選藥物轉染膠質瘤細胞后利用Trizol法提取總RNA，消化DNA后，利用反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA,定量PCR法檢測Bmi1轉錄水平。

擴增Bmi1的引物如下：

Bmi1基因上游引物Bmi1-F：GCTTCAAGATGGCCGCTTG，

Bmi1基因下游引物Bmi1-R：TTCTCGTTGTTCGATGCATTTC；

（2）利用劃痕法對膠質瘤細胞的遷移進行檢測；

（3）利用transwell法對膠質瘤細胞的侵襲進行檢測。

4.如權利要求3所述的方法，其中，所述步驟（1）中的定量PCR體系為：10μl的Premix?Ex?Taq（2×），10μmol/L的Bmi1上下游引物各0.5μl，待檢cDNA模板或陰性對照1μl，加滅菌去離子水補足體積至20μl。

5.如權利要求4所述的方法，其中，所述步驟（1）中的PCR反應條件為：95℃預變性30s；然后95℃15s，60℃20s，72℃20s，反應40個循環。

6.如權利要求3所述的方法，其中，步驟（2）中采用“劃痕法”對膠質瘤細胞的遷移進行檢測的步驟為，用待篩選藥物轉染膠質瘤細胞48小時后換無血清的膠質瘤細胞培養液繼續培養細胞12h對其進行饑餓干預。用滅菌槍頭勻速勻力的向一個方向劃單層膠質瘤細胞，每孔平行的劃1次，形成1條無細胞劃痕區。PBS清洗細胞2次，加入無血清的膠質瘤細胞培養液。在0小時，12小時和24小時顯微鏡下觀察劃痕兩側的距離變化并計算刺激前后劃痕兩側的距離。

7.如權利要求3所述的方法，其中，步驟（3）中，利用transwell法對膠質瘤細胞的侵襲進行檢測的步驟為，待篩選藥物轉染膠質瘤細胞48小時后換無血清的膠質瘤細胞培養液稀釋，種5×105個細胞在transwell小室中，外面加入膠質瘤細胞培養液，培養48小時后，用棉簽擦去上層未侵襲的細胞，用甲醇固定10min后空氣中晾干，加入DAPI染核，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，隨機數10個視野中的細胞數目，判斷帶篩選藥物能否抑制膠質瘤細胞侵襲。

8.如權利要求3所述的方法，其中，在步驟（1）之前還包括步驟：構建pmirGLO-Bmi13’-UTR和pmirGLO-Bmi13’-UTR-mut重組質粒，兩種質粒分別與待篩選藥物共轉染工具細胞293T細胞株。

9.如權利要求3所述的方法，其中，在步驟（1）之后，還包括步驟：利用Western?blot法檢測待篩選藥物對Bmi1蛋白表達的抑制作用。