[發明專利]優質東北紅豆杉莖段愈傷組織一步誘導方法

有效

• 申請號: 201310566846.7
• 申請日: 2013-11-12
• 公開（公告）號: CN103598096A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發明（設計）人: 李春斌;岳玉蓮;王劍鋒;馬洪豐;王德萍;于鶴
• 申請（專利權）人: 大連民族學院;大連市金貴緣科技開發有限公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 大連智高專利事務所(特殊普通合伙) 21235
• 代理人: 胡景波

技術領域

本發明涉及優質東北紅豆杉莖段愈傷組織一步誘導方法。

背景技術

紫杉醇（Paclitaxel，商品名Taxol）是20世紀六七十年代從紅豆杉科（Taxaceae）紅豆杉屬（Taxus?L.）植物樹皮中分離出來的一種天然的四環二萜類生物堿，因其在腫瘤治療中的獨特效果而廣受人們關注，是目前世界公認的最好的廣譜、強活性天然抗癌藥。由于紅豆杉屬植物生長緩慢，紫杉醇含量較低，僅占樹皮干質量的0.01%-0.02%，枝葉干質量的十萬分之一左右。因此隨著全球對野生紅豆杉資源保護措施的不斷加強，利用野生資源生產紫杉醇已無可能，而現階段人工種植的紅豆杉資源量還遠遠不能滿足紫杉醇生產的需求量。

因此紫杉醇其他途徑的開發就顯得極為重要，其中利用紅豆杉細胞培養技術就是一條重要的途徑，一方面可以加強對紅豆杉野生種質資源及其生態環境的保護，另一方面可以滿足供需間的差距，并且細胞培養繁殖率高，培養條件易于優化和控制，產物較易分離，從長遠來看是解決紫杉醇供需矛盾的最佳途徑。

發明內容

為了解決運用植物細胞培養技術對東北紅豆杉愈傷組織進行大規模培養困難的問題，發明人提供了優質東北紅豆杉莖段愈傷組織一步誘導方法。

本發明采用的技術方案是：

優質東北紅豆杉莖段愈傷組織一步誘導方法，即以當年生東北紅豆杉的莖段為外植體在發明人配制的誘導培養基上進行培養，最終得到疏松、淡綠色或白色的東北紅豆杉莖段愈傷組織。

所述的優質東北紅豆杉莖段愈傷組織一步誘導方法，具體包括以下步驟：

（1）外植體的消毒

取當年生東北紅豆杉的莖段，進行無菌化處理，獲得無菌的東北紅豆杉莖段外植體備用；

（2）愈傷組織誘導培養

將步驟（1）所得的消毒的紅豆杉外植體接種于誘導培養基上，控制溫度為18-22℃條件下暗培養，15天后得到誘導培養后的愈傷組織；

所述的誘導培養基的配方，按照每升計算具體為：

3792mg?KNO₃、15mg?MnSO₄·H₂O、225mg?CaCl₂·2H₂O、56mgNa₂EDTA·2H₂O、0.37mg?CoCl₂.6H₂O、0.39mg?CuSO₄·5H₂O、201mg(NH4)₂SO₄、3mgZnSO₄·7H₂O、3.0mg?NAA、41.8mg?FeSO₄·7H₂O、15mg?VB1、0.38mg?NaMoO₄.2H₂O、3.5mg?IAA、4.5mg?H₃BO₃、1.5mg煙酸、220mgNaH₂PO₄.H₂O、1.5mgKI、300mg?Vc、370mg?MgSO₄·7H₂O、1.5mg?VB₆、268.56mg肌醇、0.5-1mg2,4-D、2-3mg?IBA、0.3-0.5mg6-BA、20-30g蔗糖、7-9g瓊脂、2-3g活性炭和余量的水組成。

所述的無菌化處理可以采用已知的任何無菌化處理方式，但優選以下無菌化處理方式：將當年生東北紅豆杉的莖段經流水沖洗過夜，然后依次用酒精、氯化汞消毒,蒸餾水洗凈。更優化的具體方式，是取當年生東北紅豆杉莖段，流水沖洗10小時，然后依次用70-75％的酒精消毒80-120s、0.1％氯化汞消毒10-15min，無菌水沖洗數次，使用無菌濾紙將水分吸干。

本發明的有益效果是：

本發明以紅豆杉莖段為外植體，實驗證明，采用本發明所特有的誘導培養基，一步誘導即可達到愈傷組織誘導率100%，生長速率1.0g/L.d，15d便可長出狀態良好的淡綠色或白色愈傷組織并且可以不斷生長的效果；并且，采用本發明所述方法能最大程度的抑制外植

體褐化，在操作無失誤的情況下，能100%的避免褐化的發生。解決了本領域技術人員亟待解決的問題。具有誘導率高、誘導狀態好、誘導所需時間短、步驟少，愈傷可持續生長等特點。

附圖說明

本發明共有附圖4幅，其中：