[發(fā)明專利]鹽穗木金屬硫蛋白基因及其重組蛋白與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310566742.6
• 申請日: 2013-11-15
• 公開（公告）號: CN103614386A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉忠淵;哈斯亞提汗·阿布都拉;孟紅恩;張富春
• 申請（專利權(quán)）人: 新疆大學(xué)
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C07K14/825;C12N15/70;C12N1/21;A61K38/16;A61P39/02;A61P39/04;A61K8/64;A23L1/29
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發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。具體的說，本發(fā)明涉及一種鹽穗木金屬硫蛋白及其基因，以及含有該基因的重組表達(dá)載體、重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，以及一種重組鹽穗木金屬硫蛋白及其制備及應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

金屬硫蛋白(Metallothionein，MT)是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的低分子量、富含半胱氨酸的金屬結(jié)合蛋白。與其結(jié)合的金屬主要是鎘、銅和鋅，廣泛地存在于從微生物到人類各種生物中，其結(jié)構(gòu)高度保守。1957年Margoshes和Valles在研究鎘的生物學(xué)作用時，從蓄積鎘的馬腎中首次分離出該物質(zhì)。MT具有以下幾個特征：分子量低，一般為6～7kD；能螯合金屬離子，蛋白通過硫酯鍵與金屬結(jié)合后，具有特殊的光吸收特征；半胱氨酸含量高，約占氨基酸殘基總數(shù)的23％～33％，但不形成二硫鍵，分子中缺乏芳香族氨基酸和組氨酸；半胱氨酸殘基在氨基酸序列中具有較為保守的排列方式。金屬硫蛋白豐富的巰基含量及重金屬結(jié)合能力決定了其功能的多樣性。

近年來，對MT的研究和應(yīng)用已經(jīng)涉及到醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品保健及化妝品添加劑、生物工程、環(huán)境保護(hù)等諸多領(lǐng)域，前景十分廣闊。目前的研究證實(shí)了金屬硫蛋白具有重金屬解毒功能、清除自由基、抗輻射和紫外線照射、參與體內(nèi)微量元素的代謝、防止細(xì)胞癌變以及環(huán)保作用。隨著對金屬硫蛋白結(jié)構(gòu)、功能等研究的深入，其用途日益擴(kuò)大，對其需求量也越來越大。目前國內(nèi)生產(chǎn)MT的廠家，主要從兔肝中提取，由于MT原料需求特別，且生產(chǎn)工藝復(fù)雜，導(dǎo)致目前MT產(chǎn)量不大且價(jià)格昂貴。所以迄今為止一直缺乏一種高產(chǎn)量、低成本、安全性高、適宜于規(guī)模化生產(chǎn)MT的技術(shù)和方法。

綜上所述，克隆金屬硫蛋白基因，利用基因工程方法生產(chǎn)金屬硫蛋白是降低生產(chǎn)成本的一條有效途徑，及對其在醫(yī)藥、食品保健及化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要的意義。

鹽穗木(Halostachys?caspica)為藜科鹽穗木屬，是生長在荒漠、半荒漠鹽堿地上的重要鹽生、旱生稀鹽多汁半灌木植物，對鹽分適應(yīng)性極強(qiáng)，是鹽土荒漠主要植物之一。在高鹽和重金屬脅迫下，其體內(nèi)的金屬硫蛋白基因表達(dá)水平呈明顯上升趨勢。目前還沒有鹽穗木金屬硫蛋白及其基因的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

針對天然金屬硫蛋白含量少，傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝復(fù)雜、提取得率低的現(xiàn)狀，本發(fā)明提供一種新的鹽穗木金屬硫蛋白及其基因，含有該基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化體，以及重組鹽穗木金屬硫蛋白及其制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之一：提供一種鹽穗木金屬硫蛋白基因，所述的鹽穗木金屬硫蛋白基因具有如序列表SEQ?ID?NO.1所示的堿基序列，全長為234bp，其編碼由序列表中序列表SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列中78個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，富含半胱氨酸。

本發(fā)明技術(shù)方案之二：提供一種鹽穗木金屬硫蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ?ID?NO.2所示，來源于新疆鹽生植物鹽穗木的金屬硫蛋白。

進(jìn)一步，本發(fā)明提供鹽穗木金屬硫蛋白基因的獲得方法，通過提取鹽處理的鹽穗木總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，PCR擴(kuò)增獲得，其具體包括如下步驟：

(1)根據(jù)鹽穗木鹽抑制差減文庫中Hc6f12的EST(GenBank登錄號HS586469.1)序列的反向互補(bǔ)序列，設(shè)計(jì)引物用于擴(kuò)增鹽穗木金屬硫蛋白基因的開放讀碼框；引物中分別引入EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)。

(2)取300mM?NaCl處理的鹽穗木同化枝，應(yīng)用RNAsimple?Total?RNA?Kit提取總RNA；以O(shè)ligo(dT)為引物，按TaKaRa?M-MLV操作說明合成cDNA的第一鏈，以該cDNA第一鏈產(chǎn)物為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序：94℃5min，94℃30s，59℃30s，72℃1min，30個循環(huán)；將PCR產(chǎn)物，連接到克隆載體pMD18-T上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性單菌落進(jìn)行菌液PCR和雙酶切鑒定并測序，得到如序列表中SEQ?I?D?NO.1所示的帶有起始密碼子ATG和終止密碼子TGA的基因全長序列。

根據(jù)本發(fā)明，所述的鹽穗木金屬硫蛋白基因全長為234bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA；該序列無內(nèi)含子，具有完整的開放閱讀框，編碼78個氨基酸；編碼產(chǎn)物，即本發(fā)明鹽穗木金屬硫蛋白的氨基酸序列如表中SEQ?I?D?NO.2所示；分子量為7.7kD，等電點(diǎn)為4.78；含14個半胱氨酸和15個甘氨酸。