[發明專利]基于巨大芽孢桿菌的亞硝酸鹽還原酶大亞基外源表達方法

無效

• 申請號: 201310566256.4
• 申請日: 2013-11-13
• 公開（公告）號: CN103614395A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發明（設計）人: 周培;馮海瑋;支月娥;孫玉靜;陸偉;劉群錄;時唯偉;初少華;衛星
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/06;C12N15/70;C12R1/11
• 代理公司: 上海交達專利事務所 31201
• 代理人: 王毓理;王錫麟

技術領域

本發明涉及的是一種基因工程技術領域的方法，具體是一種亞硝酸鹽還原酶大亞基基因序列、含有該基因的重組載體、重組菌以及利用該重組菌產生該基因的表達產物及其應用。

背景技術

亞硝酸鹽還原酶是一類催化亞硝酸鹽還原的酶。亞硝酸鹽廣泛存在于腌制食物或飼料中。食品中亞硝酸鹽含量過高，會使體內血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，降低血液載氧能力，造成高鐵血紅蛋白血癥，對人體造成嚴重危害。亞硝酸鹽還可在人體內與仲胺、叔胺和氨基化合物反應形成強致癌物亞硝胺化合物，從而誘發消化系統癌變。鑒于土壤和食品中超標亞硝酸鹽鹽污染可引起環境與食品安全問題，人們正在努力尋找有效控制或降解亞硝酸鹽的方法，生物酶法成為消除食品亞硝酸鹽的一條切實可行的途徑。

發明內容

本發明針對現有技術存在的上述不足，提出一種基于巨大芽孢桿菌的亞硝酸鹽還原酶大亞基外源表達方法，克服現有技術中由于亞硝酸鹽還原酶大亞基基因序列在天然的巨大芽孢桿菌中表達量非常低，嚴重限制使用效果，應用基因工程菌表達本發明所述的亞硝酸鹽還原酶大亞基基因序列，實現極大的提高該基因的表達量。

本發明是通過以下技術方案實現的：

本發明涉及一種亞硝酸鹽還原酶大亞基基因序列，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，該亞硝酸鹽還原酶大亞基的基因序列長度為2415個堿基對，編碼804個氨基酸，分子量約為88.0KD。

本發明涉及一種基于巨大芽孢桿菌的亞硝酸鹽還原酶大亞基外源表達方法，將測序得到的亞硝酸鹽還原酶大亞基的基因序列(Bm-Nas?D)通過引物序列擴增并連接到大腸桿菌表達載體中，從而獲得重組表達載體，并進一步將重組表達載體導入大腸桿菌中，篩選到含有目的基因的轉基因重組菌。

所述的測序是指：以巨大芽孢桿菌NCT-2的基因組DNA為模板，用上述兩對引物進行PCR擴增，然后將擴增產物進行電泳檢測；并將擴增產物切膠回收后連接到pMD19-T(Simple)載體上進行測序。

所述的引物序列擴增采用的引物為PCR擴增采用的引物的5′端分別設計了EcoR?I和Stu?I酶切位點用于連接到表達載體，即：

正向引物Nas?D-Eco?R?I-F：5′-CGGAATTCATGCAAAAAAAGAAACTCGTATTGAT-3′，以及反向引物Nas?D-Stu?I-R：5′-AAGGCCTTTATGATGTGACAACTGTTTCGAACAG-3′組成。

所述的大腸桿菌表達載體為pET-41a載體。

所述的大腸桿菌為大腸桿菌BL21(DE3)。

所述的巨大芽孢桿菌NCT-2(Bacilus?megaterium)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學微生物研究所；保存日期為2011年3月21日，保藏編號為CGMCC?No.4698。

所述的重組表達載體是指：重組表達質粒pET-41a-Bm-Nas?D。

所述的轉基因重組菌是指：含有重組表達質粒pET-41a-Bm-Nas?D的大腸桿菌BL21(DE3)。

本發明涉及上述亞硝酸鹽還原酶大亞基基因序列的應用，將其用于表達目的蛋白產物。

技術效果

本發明與現有技術相比，具有以下優勢:

1、本發明提出一種全新的亞硝酸鹽還原酶大亞基基因序列；

2、本發明通過構建重組表達菌株，實現了目的蛋白的外源表達，可以顯著提高表達量；

3、本發明采用Western?Blot技術，可以對表達蛋白進行靈敏檢測，可檢測低至1-5ng(最低可至10-100pg)的蛋白。

附圖說明

圖1PCR擴增電泳示意圖。

圖2含有重組質粒pET-41a-Bm-Nas?D的DH5α平板示意圖。

圖3重組表達質粒酶切電泳示意圖。

圖4重組菌誘導表達目的蛋白的SDS-PAGE示意圖。

圖5重組菌誘導表達目的蛋白的Western?Blot-His·Tag圖。

具體實施方式

下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。

實施例1

巨大芽孢桿菌(Bacilus?megaterium)NCT-2的培養