[發明專利]基于巨大芽孢桿菌的亞硝酸鹽還原酶大亞基外源表達方法

無效

• 申請號: 201310566256.4
• 申請日: 2013-11-13
• 公開（公告）號: CN103614395A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發明（設計）人: 周培;馮海瑋;支月娥;孫玉靜;陸偉;劉群錄;時唯偉;初少華;衛星
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/06;C12N15/70;C12R1/11
• 代理公司: 上海交達專利事務所 31201
• 代理人: 王毓理;王錫麟

1.一種亞硝酸鹽還原酶大亞基基因序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

2.一種基于巨大芽孢桿菌的亞硝酸鹽還原酶大亞基外源表達方法，其特征在于，將測序得到的亞硝酸鹽還原酶大亞基的基因序列通過引物序列擴增并連接到大腸桿菌表達載體中，從而獲得重組表達載體，并進一步將重組表達載體導入大腸桿菌中，篩選到含有目的基因的轉基因重組菌。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征是，所述的測序是指：以巨大芽孢桿菌NCT-2的基因組DNA為模板，用上述兩對引物進行PCR擴增，然后將擴增產物進行電泳檢測；并將擴增產物切膠回收后連接到pMD19-T(Simple)載體上進行測序。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征是，所述的引物序列擴增采用的引物為PCR擴增采用的引物的5′端分別設計了EcoR?I和Stu?I酶切位點用于連接到表達載體，即：正向引物Nas?D-Eco?R?I-F:5′-CGGAATTCATGCAAAAAAAGAAACTCGTATTGAT-3′，以及反向引物Nas?D-Stu?I-R:5′-AAGGCCTTTATGATGTGACAACTGTTTCGAACAG-3′組成。

5.根據權利要求2所述的方法，其特征是，所述的大腸桿菌表達載體為pET-41a載體；所述的大腸桿菌為大腸桿菌BL21(DE3)；所述的巨大芽孢桿菌NCT-2(Bacilus?megaterium)保藏編號為CGMCC?No.4698。

6.根據權利要求2所述的方法，其特征是，所述的重組表達載體是指：重組表達質粒pET-41a-Bm-Nas?D。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征是，所述的轉基因重組菌是指：含有重組表達質粒pET-41a-Bm-Nas?D的大腸桿菌BL21(DE3)。

8.一種根據上述任一權利要求所述的亞硝酸鹽還原酶大亞基基因序列的應用，其特征在于，將其用于表達目的蛋白產物。