[發明專利]澳洲堅果過敏原的恒溫擴增檢測引物、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201310563936.0
• 申請日: 2013-11-14
• 公開（公告）號: CN104630333A
• 公開（公告）日: 2015-05-20
• 發明（設計）人: 劉津;張雋;李志勇;何日榮;李婷;凌莉;劉青;席靜;關麗軍
• 申請（專利權）人: 廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 鄭瑩

技術領域

本發明屬于分子生物學技術及食品安全檢測領域，涉及食品中過敏原成分的檢測方法，具體涉及澳洲堅果的LAMP檢測引物組、檢測試劑盒及檢測方法。

背景技術

澳洲堅果（Macadamia?ternifolia），又名夏威夷果、澳洲胡桃、昆士蘭栗，為山龍眼科澳洲堅果屬植物。澳洲堅果是常見的、廣泛食用的樹生堅果，是食品過敏原標識管理的重要種類。國際食品法典委員會制定的國際標準CODEX?STAN?1-1985《預包裝食品標簽通則》明確規定了澳洲堅果及其產品必須在預包裝食品標簽上予以聲明。在國際標準的基礎上，世界各國紛紛頒布了各自的法規標準，對澳洲堅果這種過敏原成分的標識管理進行了詳明的規定。歐盟委員會指令2007/68/EC和美國《食品過敏原標識和消費者保護法案》（The?Food?Allergen?Labeling?and?Consumer?Protection?Act,?FALCPA）均明確規定澳洲堅果屬于必須明確標識的食品過敏原。我國在各級食品標準中也作出了類似的規定，例如《?GB?7718-2011預包裝食品標簽通則》、《?GB/T?23779-2009預包裝食品中的致敏原成分》、《?DB11/Z?521-2008奧運會食品安全?食品過敏原標識標注》、《?DBJ?440100/T?28-2009亞運會食品安全?食品過敏原標識標注》均對此有明確的規定。

食品過敏原標識管理的有效實施，依賴于完善的技術監控手段。其中，食品過敏原檢測技術是必不可少的一個組成部分。食品過敏原的檢測技術主要分為兩類，一類是基于蛋白質的檢測方法，一類是基于基因的檢測方法。到目前為止，國內外都沒有發布過澳洲堅果過敏原成分的標準檢測方法，國外對澳洲堅果的檢測通常采用基于蛋白質檢測的免疫層析快速檢測技術，國內對澳洲堅果尚未建立任何達到行業應用水平的通用方法。這種現狀已經嚴重影響了澳洲堅果過敏原標識管理規定的科學有效實施。

現有的商業化澳洲堅果過敏原蛋白質免疫層析快速檢測方法，技術上存在明顯的局限性，并不能完全滿足食品行業生產管理和監管部門技術監督的需要。這種方法的主要技術局限性表現為：現有研究結果表明食品過敏原中能夠引起過敏反應的蛋白質組成復雜，澳洲堅果中存在的過敏原蛋白質組成尚未完全調查清楚，因此以過敏原蛋白質為檢測目標物質建立的蛋白質檢測技術得到的檢測結果存在與實際致敏效應發生偏差的可能性；基于免疫學原理的蛋白質檢測技術對檢測樣品提取物的背景干擾具有較高的要求，與此同時由于預包裝食品種類、配料成分、加工工藝千差萬別造成背景干擾非常復雜，極大局限了澳洲堅果過敏原蛋白質免疫檢測方法的實際應用效果。此外，相對于核酸而言，澳洲堅果過敏原蛋白質容易在食品加工過程中發生變性，對基于免疫學原理的蛋白質檢測技術造成不可忽略的性能下降。

相比之下，基于基因檢測的方法以食品過敏原的特異性基因片段為檢測對象，通過食品中是否存在過敏原所屬物種的保守基因片段來判斷是否含有某種特定的過敏原成分。由于核酸的穩定程度比蛋白質高，在食品加工過程中不易被破壞，因此這類技術可以更加穩定的檢測出微量的過敏原成分?，F有常用的基因檢測方法為實時熒光PCR法，但是該方法需要使用大型的儀器設備、耗時長、對技術要求高、成本昂貴，并不適用于基層實驗室的推廣應用。

環介導恒溫基因擴增技術（Loop-Mediated?Isothermal?Amplification，以下簡稱恒溫擴增法）是日本榮研化學株式會社于2000年前后開發出的基因擴增技術，是一種簡便、快速、高特異的基因擴增法，不需要昂貴的特殊設備。與實時熒光PCR方法相比成本更為低廉、操作更為簡便，更加適合基層實驗室推廣應用。

目前尚未有將LAMP法應用于快速檢測澳洲堅果的試劑盒方法。

發明內容

本發明的一個目的在于提供一種澳洲堅果過敏原的恒溫擴增檢測方法。

本發明的另一個目的在于提供一種用于檢測澳洲堅果過敏原的恒溫擴增試劑盒。

本發明的另一個目的在于提供一組用于檢測澳洲堅果過敏原的特異性恒溫擴增引物。

本發明所采取的技術方案是：

一種澳洲堅果過敏原的恒溫擴增檢測方法，包括以下步驟：

1）根據澳洲堅果過敏原基因AMP2設計特異性恒溫擴增檢測引物；

2）待檢樣品DNA在上述引物、Bst?2.0?Warmstar?DNA?聚合酶存在的條件下進行恒溫擴增反應；

3）根據擴增結果判斷待檢樣品中是否存在澳洲堅果過敏原成分。