[發明專利]澳洲堅果過敏原的恒溫擴增檢測引物、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201310563936.0
• 申請日: 2013-11-14
• 公開（公告）號: CN104630333A
• 公開（公告）日: 2015-05-20
• 發明（設計）人: 劉津;張雋;李志勇;何日榮;李婷;凌莉;劉青;席靜;關麗軍
• 申請（專利權）人: 廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 鄭瑩

1.一種澳洲堅果過敏原的恒溫擴增檢測方法，包括以下步驟：

1）根據澳洲堅果過敏原基因AMP2設計特異性恒溫擴增檢測引物；

2）待檢樣品DNA在上述引物、Bst?2.0?Warmstar?DNA?聚合酶存在的條件下進行恒溫擴增反應；

3）根據擴增結果判斷待檢樣品中是否存在澳洲堅果過敏原成分。

2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述恒溫擴增檢測引物的序列分別如下所示：

外引物1：GTGAGTCAGTGCGATAAGAG（SEQ?ID?No：1）；

外引物2：TCATATCTCCTCTCGCAGC（SEQ?ID?No：2）；

內引物1：TGGCAGTATTGTTGCTGACGTGATCCTCAGACGGAATGC（SEQ?ID?No：3）；

內引物2：ACGACGCTGCAAGGAAATATGTTGACATTGCTCGTATTGCT（SEQ?ID?No：4）；

環引物1：ATCGCCTCTGGCATTGTT（SEQ?ID?No：5）；

環引物2：CCGACAACGTGATCCACA（SEQ?ID?No：6）。

3.根據權利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于，步驟2）所述恒溫擴增反應的體系為：25μL反應體系中含有外引物1和外引物2各2～10μM、內引物1和內引物2各20～60μM、環引物1和環引物2各5～20μM、Bst?2.0?Warmstar?DNA聚合酶5～10?U、pH8.8的Tris-HCl?20?mM、KCl?8～12?mM、(NH4)₂SO_4?8～12?mM、0.08～0.12%?Tween-20、dNTPs?1.5～1.7mM、MgSO₄??0.6～1.0mM、甜菜堿0.7～0.9M，待檢樣品DNA?2μL。

4.根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，步驟2）所示恒溫擴增反應的體系為：25μL反應體系中含有外引物1和外引物2各5μM、內引物1和內引物2各40μM、環引物1和環引物2各20μM、Bst?2.0?Warmstar?DNA聚合酶8U、pH8.8的Tris-HCl?20?mM、KCl?10?mM、(NH4)₂SO_4?10?mM、0.1%?Tween-20、dNTPs?1.6mM、MgSO₄?0.8mM、甜菜堿0.8M，待檢樣品DNA?2μL。

5.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟2）所述恒溫擴增反應的程序為：63～65℃恒溫反應45～60min。

6.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟3）可采用曲線法或顯色法判斷擴增結果，曲線法：在反應體系中恒溫加入1-20?μM?SYTO-9使用熒光PCR儀或其它恒溫熒光檢測儀進行檢測，根據擴增曲線判斷結果，有“S”型擴增曲線的為陽性，無“S”型擴增曲線的為陰性；顯色法：在反應體系中加入500-2000×GeneFinder，根據顏色判斷結果，陽性為綠色，陰性為橙色。

7.一種用于檢測澳洲堅果過敏原的恒溫擴增試劑盒，其包括6條根據澳洲堅果過敏原基因AMP2設計特異性恒溫擴增檢測引物。

8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述恒溫擴增檢測引物的序列分別如下所示：

外引物1：GTGAGTCAGTGCGATAAGAG（SEQ?ID?No：1）；

外引物2：?TCATATCTCCTCTCGCAGC（SEQ?ID?No：2）；

內引物1：TGGCAGTATTGTTGCTGACGTGATCCTCAGACGGAATGC（SEQ?ID?No：3）；

內引物2：ACGACGCTGCAAGGAAATATGTTGACATTGCTCGTATTGCT（SEQ?ID?No：4）；

環引物1：ATCGCCTCTGGCATTGTT（SEQ?ID?No：5）；

環引物2：CCGACAACGTGATCCACA（SEQ?ID?No：6）。