[發明專利]一種用于食品病原微生物鑒定的單個核酸分子檢測技術

有效

• 申請號: 201310563819.4
• 申請日: 2013-11-14
• 公開（公告）號: CN103740808A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發明（設計）人: 周東蕊;張紅琳;白志茂;嚴勇;陸祖宏;肖鵬峰;李清寧
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 北京瑞思知識產權代理事務所(普通合伙) 11341
• 代理人: 李濤

技術領域

本發明涉及微生物分子檢測技術領域，特別是涉及一種用于食品病原微生物鑒定的單個核酸分子檢測技術。

背景技術

食品安全問題越來越受到人們的重視，致病微生物對食品的污染問題歷來是人們關注的首要食品安全問題。要從根本上解決食品安全問題，就必須對食品的生產、加工、流通和銷售等各環節實施全程管理和監控，這就需要大量能夠滿足這一要求的快速、方便、準確、靈敏的食品安全分析檢測技術，同時一旦發生食源性致病微生物中毒事件，也需要在最短時間內完成檢測，以制定科學合理的治療方案，贏得治療時間。這些快速分析檢測技術的推廣應用，不僅是對傳統的食品安全分析檢測技術的改進和提高，也使食品的質量安全有了進一步的保證。

近年來，隨著各項科學技術的發展，食品安全快速分析檢測技術也得到了一定程度的發展。目前，食品安全快速分析檢測方法主要有三類：培養法、免疫學方法和分子生物學方法。

培養法是最早發展起來的鑒定細菌的方法。目前，該種方法已改進為在培養基中加入特異性的生化反應底物、抗體、熒光反應底物、酶反應底物等，使目標培養物的選擇、分離和鑒定一次性完成。紙片法就是在培養法基礎上發展起來的一種新型檢測方法。該方法以紙片、紙膜和膠片等作為培養基載體，將特定的培養基和顯色物質附著在培養基載體上，通過微生物在培養基和顯色物質上的生長、顯色來測定食品微生物。目前雖然已有紙片法產品運用于臨床檢測，但該方法仍存在較多不足之處，如培養檢測仍需要較長的檢測時間（約24小時）；顯色指示劑系統單一，不能對細菌有區別地分類分析；測試紙檢測的指標較少，通量低等。由于這些不足，紙片法產品的生產和臨床運用仍然較少。

免疫學方法通過抗原和抗體的特異性結合反應，再輔以免疫放大技術來鑒別細菌。酶聯免疫吸附法是一種固相酶免疫分析方法，其是把抗原抗體免疫反應的特異性和酶的高效催化作用有機地結合起來的一種檢測方法。該方法既可測抗原，也可測抗體，還可以進行定性和定量。但該方法也存在著如檢測時間較長、致病菌單克隆抗體難以制備、使用多抗容易產生交叉反應而出現假陽性以及一次只能檢測一種或幾種致病菌等缺點和不足。流式細胞計數具有高度的敏感性，可同時對目的菌進行定性和定量。但該方法的成本較高，不僅流式細胞儀極為昂貴，而且對操作者的要求也較高。

隨著分子生物學技術的發展，一些分子生物學檢測技術與手段也開始應用于食品致病微生物的檢測。實時定量PCR技術是在PCR基礎上發展起來的一項新技術，該技術通過直接測定PCR過程中熒光信號的變化，利用電腦分析軟件對PCR過程中產生的擴增產物進行動態監測和自動定量，從而成功地實現了PCR從定性到定量的飛躍。然而，實時熒光定量PCR技術常由于受到寡核苷酸雜交特異性、TaqMan探針比例和染料濃度大等因素的影響，引起定量結果出現偏差或導致假陽性和假陰性結果。

基因芯片技術基于芯片上的探針與樣品中的靶基因片段之間發生特異性核酸雜交，具有高通量、高靈敏度、準確、快速等特點。其不足之處是芯片技術本身具有較多問題，如特異性問題、假陰性和假陽性問題、芯片的產品質量和可靠性問題等。

因此，目前還需要開發可快速、高效檢測致病菌的新技術。

發明內容

本發明主要解決的技術問題是提供一種用于食品病原微生物鑒定的單個核酸分子檢測技術，能夠快速、高效檢測致病菌。

為解決上述技術問題，本發明采用的一個技術方案是：提供一種用于食品病原微生物鑒定的單個核酸分子檢測技術，檢測步驟如下：

（1）分離待檢測食品中的微生物，并提取基因組DNA；采用超聲波或DNA破碎酶將上述基因組DNA隨機打斷成200～1000bp的片段；

（2）用DNA合成儀合成一條探針，并用丙烯酰胺對探針進行標記；

（3）將步驟（2）中標記后的探針與步驟（1）中打斷的基因組DNA片段雜交；

（4）將步驟（3）中雜交后的溶液與丙烯酰胺貯存液混合，將均勻混合液平鋪于基片上進行凝固形成膠，然后用非變性電泳液電泳去除未雜交上去的片段和未膠連上去的分子；

（5）向步驟（4）中電泳后的膠上滴加核酸分子擴增反應液、核酸熒光染料混合液，將混合液與膠一起密封在基片上并置于控溫裝置中，進行核酸分子原位擴增；

（6）用分辨率高于2048×2048的熒光顯微鏡或掃描儀進行熒光信號采集，根據陽性點的數量判斷待檢測樣本的病原菌是否存在。

在本發明一個較佳實施例中，所述病原微生物為細菌、古細菌、真菌、病毒、支原體和藻類，來自于食品、水、空氣和患者排瀉物。