[發明專利]一種堿性細菌漆酶在酵母中的高通量表達方法

有效

• 申請號: 201310563136.9
• 申請日: 2013-11-14
• 公開（公告）號: CN103820401B
• 公開（公告）日: 2017-05-03
• 發明（設計）人: 李洋;王行國;彭夢;王慧敏
• 申請（專利權）人: 湖北大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/81;C12R1/84;C12R1/38
• 代理公司: 北京高沃律師事務所11569
• 代理人: 王加貴

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，涉及一種堿性細菌漆酶在酵母中的高通量表達方法。

背景技術

漆酶(Laccase EC1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶，能催化酚類和芳香類化合物的氧化，使之生成相應的苯醌，同時伴隨電子的轉移，將分子氧還原成水。由于漆酶能夠氧化芳香類化合物和其它一些非芳香類有機物，具有廣泛的底物特異性，因此在紙漿漂白、紡織品染料脫色、有毒廢棄物的去除、生物修復、醫療診斷或作偽抗癌藥物制備的催化劑以及生物傳感器等方面具有巨大的應用潛力。漆酶不僅存在于植物中，還廣泛存在于真菌中。而最新研究表明，某些昆蟲甚至細菌也可產生具有漆酶活性的物質。近年來隨著研究的深入，真菌漆酶的工業用途日益受到人們的關注，但真菌漆酶只在酸性范圍有活性，嚴重地限制了該酶的工業應用。而細菌漆酶則在某些方面如高溫、高壓、高pH的條件下比植物漆酶和真菌漆酶更具有優勢。但目前細菌漆酶主要在原核表達系統中表達，其表達量及活性仍然較低，需要進一步提高才能滿足工業上的需要。相比較而言，酵母表達系統具有分泌表達的優勢，可進行高密度發酵，重組蛋白表達量高，因此可以利用酵母表達系統的優勢來實現細菌漆酶的高通量表達。

發明內容

為了克服現有技術中存在的缺陷，本發明提供一種堿性細菌漆酶在酵母中的高通量表達方法，通過基于語義的模型發現來幫助建模者，更加高效、合理的完成模型的組合建模，從而解決了堿性細菌漆酶在原核表達系統中易形成包涵體及產量、酶活性低的問題。其技術方案如下：

一種堿性細菌漆酶在酵母中的高通量表達方法，包括以下步驟：

A、堿性細菌漆酶基因的畢赤酵母表達載體構建

(1)在50μl的體系中，加入5μl10×限制性內切酶反應緩沖液，并按1μg DNA：3-5U限制性內切酶的比例加入DNA和限制性內切酶CpoI和NotI，混勻后37℃保溫2-12h，使用該方法分別用相同的限制性內切酶消化切割ppic9K質粒DNA和已擴增的細菌漆酶基因DNA，為了方便純化，在基因終止密碼子后設計一段組氨酸標簽；

(2)用1％瓊脂糖凝膠電泳分離限制性內切酶消化樣品，在紫外燈下用刀片切出目的DNA片段，然后按DNA片段回收試劑盒的方法回收目的DNA片段；

(3)在25μl的體系中，加入2.5μl10×T₄DNA連接酶反應緩沖液，并按1∶5的比例加入限制性內切酶消化過的pPic9k質粒DNA和細菌漆酶基因DNA，再加入1μlT₄DNA連接酶，16℃水浴4-12h將細菌漆酶基因插入ppic9K質粒上的多克隆位點形成一個重組表達質粒；

B、陽性轉化子的篩選

利用常規的CaCl₂法制備E.coli DHlOB感受態細胞，然后將5-10μl連接反應混合物與100μlE.coli DHlOB感受態細胞混合，冰浴30min，42℃熱休克1.5min后立即置冰上5min，加入900μl新鮮LB培養基后在37℃搖床上培養45min，搖床轉速為150rpm，然后將細菌涂布在含100μg/ml氨芐青霉素(Amp)的LB平板上，37℃培養12h，平板上長出的單個菌落即為陽性轉化子；

C、酵母表達載體的線性化

SalI分別酶切原始載體重組載體ppic9K-laccase，1％瓊脂糖凝膠回收含目的基因的重組線性化載體，15ulddH₂O-20℃保存備用；

D、酵母電轉感受態的制備

挑取單克隆GS115接種于10mlYPD液體培養基中，200rpm/min，30℃搖床培養過夜，以1％接種量轉接至100mlYPD液體培養基，30℃搖床過夜OD＝1.1-1.3，在4℃離心5000rpm，5min，棄上清，用100ml冰預冷無菌水重懸菌體，重復一次，在4℃離心5000rpm，5min，棄上清，用20ml冰預冷1mol/L的山梨醇重懸菌體，重復1次，山梨醇的量減為5ml，最后在4℃6000rpm，8min離心棄上清，用400ul冰預冷1mol/L的山梨醇重懸均勻，按100ul分裝于1.5ml預冷無菌EP管中，零度備用。

E、重組子的表達鑒定