[發明專利]一種堿性細菌漆酶在酵母中的高通量表達方法

有效

• 申請號: 201310563136.9
• 申請日: 2013-11-14
• 公開（公告）號: CN103820401B
• 公開（公告）日: 2017-05-03
• 發明（設計）人: 李洋;王行國;彭夢;王慧敏
• 申請（專利權）人: 湖北大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/81;C12R1/84;C12R1/38
• 代理公司: 北京高沃律師事務所11569
• 代理人: 王加貴

1.一種堿性細菌漆酶在酵母中的高通量表達方法，其特征在于，包括以下步驟：

A、帶有堿性細菌漆酶基因的畢赤酵母表達載體構建

(1)從一株蒼白桿菌基因組擴增得到漆酶編碼基因，命名為511lac經測序鑒定如：SEQ ID NO：1所示；

(2)在50μl的體系中，加入5μl 10×限制性內切酶反應緩沖液，并按1μg DNA∶3-5U限制性內切酶的比例加入DNA和限制性內切酶Cpo I和Not I，混勻后37℃保溫2-12h，使用該方法分別用相同的限制性內切酶消化切割pPic9K質粒DNA和已擴增的細菌漆酶基因DNA，在基因終止密碼子后設計一段組氨酸標簽；

(3)用1％瓊脂糖凝膠電泳分離限制性內切酶消化樣品，在紫外燈下用刀片切出目的DNA片段，然后按DNA片段回收試劑盒的方法回收目的DNA片段；

(4)在25μl的體系中，加入2.5μl 10×T₄DNA連接酶反應緩沖液，并按1∶5的比例加入限制性內切酶消化過的pPic9k質粒DNA和細菌漆酶基因DNA，再加入1μl T₄DNA連接酶，16℃水浴4-12h將細菌漆酶基因插入pPic9K質粒上的多克隆位點形成一個重組表達質粒；

B、陽性轉化子的篩選

利用常規的CaCl₂法制備E.coli DH10B感受態細胞，然后將5-10μl連接反應混合物與100ul E.coli DH10B感受態細胞混合，冰浴30min，42℃熱休克1.5min后立即置冰上5min，加入900μl新鮮LB培養基后在37℃搖床上培養45min，搖床轉速為150rpm，然后將細菌涂布在含100μg/ml氨芐青霉素Amp的LB平板上，37℃培養12h，平板上長出的單個菌落即為陽性轉化子；

C、酵母表達載體的線性化

Sal I分別酶切原始載體重組載體pPic9K-laccase，1％瓊脂糖凝膠回收含目的基因的重組線性化載體，15ul ddH₂O-20℃保存備用；

D、酵母電轉感受態的制備

挑取單克隆GS115接種于10ml YPD液體培養基中，200rpm/min，30℃搖床培養過夜，以1％接種量轉接至100ml YPD液體培養基，30℃搖床過夜OD＝1.1-1.3，在4℃離心5000rpm，5min，棄上清，用100ml冰預冷無菌水重懸菌體，重復1次，在4℃離心5000rpm，5min，棄上清，用20ml冰預冷1mol/L的山梨醇重懸菌體，重復1次，山梨醇的量減為5ml，最后在4℃6000rpm，8min離心棄上清，用400ul冰預冷1mol/L的山梨醇重懸均勻，按100ul分裝于1.5ml預冷無菌EP管中，零度備用；

E、重組子的表達鑒定

挑取MD平板上的轉化子接于5ml BMGY：0.1mol/L PB pH6.0，CuSO₄0.4mmol/L中，標記菌株后置于30度搖床200rpm/min過夜培養，直到OD₆₀₀為2.5時，8000rpm/min離心5分鐘，去上清，每管以5ml BMMY：0.1mol/L PB pH6.0，0.5％甲醇，CuSO₄0.4mmol/L重懸，200rpm/min轉速下30度搖床誘導培養，每隔24小時補加5％的甲醇，從第36小時開始以ABTS檢測漆酶活性，每隔12小時取100ul菌液，12000rpm/min離心3分鐘后取其上清用于檢測漆酶活性，以選擇漆酶表達量高的酵母重組菌株，漆酶反應體系如下：0.02mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液pH3.6，0.5mmol/L ABTS，20ul酵母表達上清，0.2mmol/L CuSO₄，補充雙蒸水至1ml，以轉化的負對照為本底，在420nm處測定其在3分鐘內催化底物ABTS的μmol數；

F、融合蛋白的純化

將50ml上清粗酶液與10ml Ni²⁺離子親和層析樹脂混合，4℃緩慢搖動4-12h，然后將混合物裝柱，柱直徑2mM、柱高10mM，用10倍柱床體積的PBS*(pH7.4)緩沖溶液平衡柱子，流速控制在1mL/min至1.2mL/min，當柱中平衡溶液快接近凝膠柱界面時，封住下端出口，將結合后的填料再次上柱分別用5倍柱體積的I-40：40mM Imidazole in PBS Buffer和2倍柱體積的I-45Buffer：45mM Imidazole in PBS Buffer洗脫，流速為自然流出，收集洗脫液，每次洗脫時，用1.5ml Eppendorf管收集，每管收集1.5ml，這一步用來除去與鎳非特異性結合的雜蛋白，分別用用I-250Buffer：250mM Imidazole in PBS Buffer洗脫，流速為自然流出，收集洗脫液，收集方法與上相同，目的蛋白在這一步從柱上被洗脫下來，最后用I-1000Buffer：1M Imidazole in PBS Buffer洗脫，流速為自然流出，不必收集洗脫液，收集洗脫峰，目的蛋白經10％SDS-PAGE電泳鑒定，純化后的蛋白經65％硫酸銨沉淀濃縮后再用50mM磷酸緩沖液pH7.2透析去除殘余的硫酸銨，在實驗室搖瓶發酵條件下，從1L培養物中可獲得50-80mg純蛋白；

G、酶動力學參數測定

使用漆酶底物ABTS(2，2’-聯氮基-雙(3-乙基苯丙噻唑啉-6-磺酸))和DMP(2，6-二甲基苯)檢測，麥芽糖結合蛋白-細菌漆酶融合蛋白具有與未融合的細菌漆酶相似的酶動力學參數，以DMP為底物時，反應體系為50mM TrisHCl pH8.0、0.2rnM CuSO₄和不同濃度的DMP0.2、0.3、0.4、0.6和1mM，在反應體系中加入1-5μl適量稀釋的純酶后啟動反應，用MV-2550型紫外分光光度計在37℃條件下測定477nm的吸收光度值；以ABTS為底物時，反應體系為50mM醋酸緩沖液pH3.0、0.2mM CuSO₄和不同濃度的ABTS0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和2mM，在反應體系中加入1-5μl適量稀釋的純酶后啟動反應，用MV-2550型紫外分光光度計在37℃條件下測定420nm的吸收光度值；再根據吸收值的改變ΔA值和消光系數ε計算出單位時間內產物的生成量即酶反應速度υ，DMP在477nm處的消光系數為14.8mM^-1cm^-1，ABTS在420nm處的消光系數為36mM^-1cm^-1，酶活力定義為在37℃條件下每分鐘氧化1μg底物為1個酶活力單位，然后再根據Lineweaver-Burk雙倒數作圖法1/v＝(Km/Vmax)*1/[S]+1/Vmax求出酶動力學參數Km、Vmax和Km/Vmax值。