[發明專利]一種用于檢測馮維勒布蘭德因子的試劑及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201310562657.2
• 申請日: 2013-11-12
• 公開（公告）號: CN103760358A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 趙鐵銘;李小林;王枕亞;喜慶
• 申請（專利權）人: 趙鐵銘;喜慶
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種檢測人血清中馮維勒布蘭德因子(vWF，von?Willebrand?Factor)的試劑盒及其制備方法。

背景技術

馮維勒布蘭德因子(vWF，von?Willebrand?Factor)，又稱血管性血友病因子，是由第12號染色體上的vWF基因編碼，是一種大分子量的多亞基糖蛋白，由多個220kD的亞基組成。終產物的聚合度不一，分子量最高者可高達20MD。組裝完成后儲存于血小板的α顆粒、血管內皮的Weibel-Palade小體中；其是存在于血液中的一種多功能多價的大型粘附糖蛋白。vWF因子在止血和血栓形成過程中具有極其重要的生理作用：一方面，調節介導血小板粘附反應，并且通過與血小板上的受體和膠原蛋白的結合來調節血小板在血管內皮上的粘附，主要過程是：血管內皮受損→暴露膠原纖維→vWF因子連接膠原纖維→血小板表面糖蛋白I?b受體結合vWF因子從而粘附在受損血管上，本功能主要由大分子量的多聚體完成；另一方面，還可與VIII(FVIII)的載體蛋白(VIII因子)非共價結合，從而保護VIII因子免于遭受包括活化的蛋白C在內的蛋白酶的攻擊，防止VIII因子被過早清除，正常的止血過程就不會因VIII因子受酶切而異常。因此，血液中正常的馮維勒布蘭德因子是極為關鍵的，其水平的降低和功能的缺失則會導致血凝功能相關的疾病發生，此類疾病都是由于止血和血栓形成過程異常造成的；其中最常見的是馮維勒布蘭德病和血友病，其中因vWF因子所致的血友病為最常見的血友病，國外報道的患病率高達1％～3％。所以，檢測血液中馮維勒布蘭德因子的含量至關重要，能夠提供對于上述疾病診斷和治療的關鍵性參考數據。

此外，隨著近年來科研的發展，馮維勒布蘭德因子的一些其他功能逐漸被人們所了解。它在血管生成，平滑肌細胞的增殖，癌細胞的擴散，以及免疫過程中都具有一定的調控作用。因此，它在一些心血管疾病，癌癥，肝病和免疫疾病中可以被用作生物標記物來加以研究和使用。總之，檢測血液中馮維勒布蘭德因子的含量不僅在與止血和血栓形成過程有關的疾病，而且在其他很多疾病的診斷和治療中都有很高的價值。

現有技術中，檢測馮維勒布蘭德因子的方法有多種，例如：馮維勒布蘭德因子多聚體法是將樣品用瓊脂膠來分離從而判斷多聚體是否正常；酶聯免疫法(ELISA)是用包被在塑料板表面的抗體與樣品中的抗原結合從而檢測馮維勒布蘭德因子的含量；膠原蛋白法與酶聯免疫法類似，只不過包被在塑料板表面的不是抗體，而是膠原蛋白，此法利用馮維勒布蘭德因子和膠原蛋白可以天然高效結合的特點來進行它的檢測。其中，酶聯免疫法主要用來檢測馮維勒布蘭德因子的含量，而多聚體法和膠原蛋白法還可在一定程度上檢測其活性。

以上檢測方法各具特點，而它們共同的最大的局限是不能應用于實驗室自動分析檢測儀器如自動血凝儀上，無法進行大量快速且具有高度重復性的檢測。多聚體法需手工制備瓊脂膠，而整個實驗的時間也較長。酶聯免疫法和膠原蛋白法由于包被在塑料板表面時效率的不同導致實驗的重復性不好。

膠乳免疫比濁法具有操作簡便、快速、檢測靈敏度高、特異、定量準確等優點，在臨床應用上得到廣泛認可。

早期免疫分析通過觀察沉淀物形成，凝集及溶血現象發生來分析，如免疫擴散、免疫電泳、血凝試驗、補體結合等。上世紀50年代末60年代初，利用AG-AB復合物形成使濁度改變，再用比濁計來比濁，但因其敏感性差未被接受。至70年代初，開始有自動檢測系統，但因其用的是激光為光源，固定波長，靈敏度較低，而且時間一般要2-3小時，很難滿足臨床需要。70年代未，速率比濁計的出現，使抗原抗體結合的反應在幾十秒內出結果，可以說是免疫化學測定的革命性的發展。

隨著標記技術的發展，免疫化學納入臨床化學檢驗范疇。免疫濁度測定的基本原理是：抗原抗體在特殊緩沖液中快速形成抗原抗體復合物，使反應液出現濁度。當反應液中保持抗體過量時，形成的復合物隨抗原量增加而增加，反應液的濁度亦隨之增加，與一系列的標準品對照，即可計算出受檢物的含量。

免疫濁度測定法按照儀器設計的不同可以分為兩種，即比濁儀測定(turbidimetermeasure)和散射比濁儀測定(nephelomitermeasure)。比濁儀測定是測量由于反射、吸收或散射引起的入射光衰減，其讀數以吸光度A表示。A反映了入射光與透射光的比率。散射比濁儀測定是測量入射光遇到質點(復合物)后呈一定角度散射的光量，該散射光經放大后以散射值表示。