[發明專利]一種檢測單糖的方法及衍生試劑的制備方法

有效

• 申請號: 201310561748.4
• 申請日: 2013-11-09
• 公開（公告）號: CN103575827A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發明（設計）人: 張麗娟;韓章潤;曾洋洋;蘭瑩;邱培菊
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;C07D231/22
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技術領域

本發明屬于醫藥領域，涉及一種檢測單糖的方法及衍生試劑的制備方法。

背景技術

目前，多糖領域中面臨很多挑戰。多糖的研究不僅僅限于對大量樣品的分析，對于生物來源的樣品研究也越來越多。由于生物來源(如血液、細胞、組織)的樣品多糖量少，單糖極性較強，結構相近，且缺乏光學活性，采用常規方法對其分離鑒定較為困難。糖在紫外區無吸收，傳統的示差折光檢測法的靈敏度低且不利于梯度洗脫。為了改善其分離選擇性和提高檢測靈敏度，人們常采用衍生化處理，將糖類組分轉變為帶發色基團的分子，然后進行紫外或熒光檢測。

液相色譜質譜聯用(LC-MS)是一種很好的檢測方法。它以液相色譜作為分離系統，質譜為檢測系統。樣品由流動相分離，被離子化后，經質譜的質量分析器將離子碎片按質量數分開，經檢測器得到質譜圖。液質聯用體現了色譜和質譜的優勢互補，將色譜對復雜樣品的高分離能力，與質譜具有高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對分子質量與結構信息的優點結合起來，在藥物分析、食品分析和環境分析等許多領域得到了廣泛的應用。

糖類物質的衍生反應多基于還原氨化法，不僅過程繁瑣、反應時間長，而且可導致不穩定基團如唾液酸殘基的解離，給測定結果帶來偏差。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，常被用于衍生單糖，結合高效液相色譜法分析，具有反應條件較溫和，產物無立體異構等優點。1-萘-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP)也是常用的衍生試劑，如孫志偉等用NMP衍生測定油菜花粉多糖中單糖的組成(孫志偉，劉凌君，戶寶軍，等.1-(2-萘基)-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生試劑的制備及其在高效液相色譜-質譜法測定糖類化合物中的應用[J].色譜,2008(02)：200-205)，其反應機理與PMP相同，都可以與單糖反應生成具有紫外吸收的糖-雙衍生試劑產物，但是以上兩種衍生試劑都存在檢測限高，樣品消耗量大，用質譜檢測只能對樣品定性，不能定量等缺點。用普通衍生試劑衍生結合LC-MS對單糖定量，需要做一系列的標準曲線，不僅步驟繁瑣，而且對珍貴的生物樣品來說也是一種浪費，同時單糖的分離結果并不理想。

發明內容

針對以上現有技術存在的不足，本發明的目的是提供一種定性定量檢測單糖的方法。

實現上述發明目的的技術方法是：

1.一種檢測單糖的方法，具體包括如下步驟：

(1)用衍生試劑對單糖進行衍生；

(2)將衍生產物進行液相色譜質譜聯用(LC-MS)分析；

所述的衍生試劑包括1-萘-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D3NMP)和1-萘-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP)；

所述的衍生試劑D3NMP單獨使用或與NMP聯用。

2.一種檢測單糖的方法，其特征在于，所述的單糖為動物、植物和微生物來源的多糖及寡糖的基本組成單元。

3.D3NMP的制備方法包括如下步驟：

(1)稱取萘肼鹽酸鹽，置于水中，加熱至100℃，使其完全溶解，用20％NaOH溶液調節PH至8-9，抽濾后得到固體，用水洗滌直至PH為7，抽濾后真空干燥，得萘肼；

(2)將萘肼加入無水乙醇中，于55℃水浴條件下攪拌至其溶解，滴加氘代乙酰乙酸乙酯，滴加完畢后反應2h，然后升溫至80℃回流7h，將反應液減壓濃縮至原體積的1／3，用甲醇將其重結晶3次，得D3NMP；

其中萘肼與氘代乙酰乙酸乙酯的物質量之比為1.2：1。

反應方程式如下：

與現有技術相比，本發明具有以下優點：

本發明方法對微量樣品既可以定性又可以定量，檢測靈敏度高，操作簡便，可以同時對兩種未知樣品進行相對定量，質譜圖信噪比低，分離所需的流動相極生小，對色譜柱有很好的保護作用，大大延長了柱子的使用壽命。本發明方法比傳統PMP衍生法的靈敏度高4-5倍，比傳統NMP衍生法能夠更好地分離單糖，不會出現單糖色譜峰重疊的現象。

附圖說明

圖1為七種單糖標準品D3NMP衍生產物的紫外吸收圖。

圖2為葡糖糖NMP衍生物及葡萄糖D3NMP衍生物的質譜圖。

圖3為葡糖糖醛酸NMP衍生物及葡萄糖醛酸D3NMP衍生物的質譜圖。

圖4為葡糖糖胺NMP衍生物及葡萄糖胺D3NMP衍生物的質譜圖。

圖5為未知樣品1的NMP衍生物及未知樣品2的D3NMP衍生物的質譜圖。

圖6為七種單糖標準品PMP衍生產物與D3NMP衍生產物紫外吸收對比圖。

圖7為標準單糖NMP衍生物的色譜分離圖。