[發明專利]帶Flag標簽的LAMP1真核表達載體及其在溶酶體分離中的應用

在審

• 申請號: 201310560532.6
• 申請日: 2013-11-12
• 公開（公告）號: CN104630264A
• 公開（公告）日: 2015-05-20
• 發明（設計）人: 張磊;李紅昌;楊詩涵
• 申請（專利權）人: 中國科學院深圳先進技術研究院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;C12N5/07
• 代理公司: 深圳市科進知識產權代理事務所(普通合伙) 44316
• 代理人: 沈祖鋒;郝明琴

【技術領域】

本發明屬于分子生物學技術領域，特別涉及一種帶Flag標簽的LAMP1（溶酶體膜蛋白1）真核表達載體及其在溶酶體分離中的應用。

【背景技術】

溶酶體（lysosome）是真核細胞中由單層脂蛋白膜包繞的含一系列酸性水解酶的小體，是細胞內吞和細胞自噬兩條代謝途徑的共同終點。溶酶體既能通過與吞噬體融合，酸化水解通過內吞途徑進入細胞的生物大分子物質，調節細胞水平的信號傳遞，又能通過與自噬體融合，降解通過自噬途徑包裹到自噬體中的細胞器和內源性生物大分子，為細胞提供生物合成的新原料。通過分子生化手段分離溶酶體對于研究細胞內吞和細胞自噬兩條代謝途徑意義重大。傳統應用于分離溶酶體的方法主要是密度梯度離心。密度梯度離心法是指用一定的介質在離心管內形成一連續或不連續的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿液置于介質的頂部，通過重力或離心力場的作用使細胞裂解液分層、分離。該方法通過利用細胞中不同細胞器的沉降系數不同，在一定離心力作用下，細胞器會分布到密度梯度的不同區域中，最后再通過免疫印跡法鑒定出溶酶體所分布的區域，并將這一區域都作為溶酶體分離出來。

密度梯度離心法分離溶酶體耗時長，分離效率低，而且無法得到純度較高的溶酶體。LAMP1是溶酶體表面特異性定位的膜蛋白，被廣泛的用作溶酶體的標識物。LAMP1蛋白分子的大部分區域定位于溶酶體的內腔中，僅有C端一小部分跨過溶酶體膜，暴露在溶酶體表面與胞漿接觸。依據LAMP1的特性，我們以LAMP1蛋白作為溶酶體的標識物，用免疫沉淀的方法分離溶酶體，會簡化了純化步驟，提高了分離得到的溶酶體的純度。而現有的靶向細胞內源性LAMP1的抗體特異性和效價都不高，不離于高效的分離溶酶體。用傳統的密度濃度梯度法分離溶酶體具有耗時長，樣品需求量大，而且無法得到純度較高的溶酶體。

【發明內容】

本發明的首要目的在于提供一種帶Flag標簽的LAMP1真核表達載體。

本發明的另一目的在于提供所述帶Flag標簽的LAMP1真核表達載體在溶酶體分離中的應用。

本發明的目的通過以下技術方案實現：一種帶Flag標簽的LAMP1真核表達載體，其中所含的帶Flag標簽的LAMP1的核苷酸序列為（如SEQ?ID?NO.1所示）：