[發(fā)明專利]雙水相萃取快速分離純化右旋糖酐蔗糖酶的方法

無效

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• 申請日: 2013-11-12
• 公開（公告）號: CN103571806A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發(fā)明（設計）人: 陳山;劉玫;梁贏;張義平;姚曉麥;浦媛媛;鄒青松;黃磊;謝政;相萍萍
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 楊立華

技術領域

本發(fā)明屬于生物分離工程技術領域，尤其涉及一種雙水相萃取快速分離純化右旋糖酐蔗糖酶的方法。

背景技術

右旋糖酐蔗糖酶（Dextransucrase，系統(tǒng)分類號EC2.4.1.5）屬于糖酐水解酶70家族(Family70)，由腸膜明串珠菌發(fā)酵獲得，是一種催化蔗糖合成右旋糖酐的糖基轉移酶，催化合成的右旋糖酐可作為血漿代用品，在食品、醫(yī)藥、化工等行業(yè)均具有廣泛的應用。但是，腸膜明串珠菌發(fā)酵得到的右旋糖酐蔗糖酶含有多種雜質，與產物葡聚糖混合在一起，以致粗酶液非常粘稠，給酶的分離純化造成了極大的困難。

目前，有多種方法可用于右旋糖酐蔗糖酶的分離純化，如硫酸銨沉淀法、超濾、有機溶劑沉淀法、色譜分離等。硫酸銨沉淀法在很大程度上損傷了右旋糖酐蔗糖酶的活性，當用質量濃度超過80%的硫酸銨處理時，酶活回收率不超過10%。超濾法雖具有較高的酶活回收率，但粗酶液粘度高，易造成膜堵塞，膜通量下降較快，不適合工業(yè)化應用。有機溶劑沉淀法的沉淀特異性高于硫酸銨沉淀法，且沉淀不用脫鹽，過濾較為容易，但是容易引起酶的變性失活。色譜分離一般與其他純化方法（如超濾、鹽析、葡聚糖酶降解）等結合使用，雖然它能得到純度較高的酶，但易造成酶污染、酶活損失嚴重、處理量少，只能用于實驗室規(guī)模，很難進行工業(yè)化生產。

雙水相萃取是指兩種親水性聚合物水溶液在一定條件下可以形成雙水相，利用被分離物在兩相中分配系數不同而實現分離的技術，該法具有易分相、價格低廉、萃取高效溫和、無毒、萃取物活性損失小、除雜能力強、萃取率高、可連續(xù)操作、安全方便等優(yōu)點，可廣泛的用于蛋白質、酶、核酸、氨基酸、多肽、細胞器等產品的分離和純化。

發(fā)明內容

本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種操作簡單、快速高效的雙水相萃取快速分離純化右旋糖酐蔗糖酶的方法，以提高右旋糖酐蔗糖酶的酶活回收率、節(jié)約純化時間。

為解決上述技術問題，本發(fā)明采用以下技術方案：雙水相萃取快速分離純化右旋糖酐蔗糖酶的方法，包括以下步驟：

(1)用腸膜明串珠菌發(fā)酵產右旋糖酐蔗糖酶制備右旋糖酐蔗糖酶粗酶液；

(2)向步驟(1)的粗酶液中添加聚乙二醇（PEG）和外源性葡聚糖(Dextran)構建PEG/Dextran雙水相體系；

(3)將步驟(2)的PEG/Dextran雙水相體系低溫靜置分層和高速離心分離；

(4)將步驟(3)分離的下相透析濃縮即得右旋糖酐蔗糖酶(含葡聚糖)。

步驟(1)按以下操作進行：將腸膜明串珠菌CICC21724在43號固體培養(yǎng)基斜面試管中復活后，接種至43號固體培養(yǎng)基；待長出茁壯的單菌落后，挑取2環(huán)單菌落接種至種子培養(yǎng)基；待菌種繁殖至對數期時，以2%(v/v)的接種量接種于產酶培養(yǎng)基，培養(yǎng)20-26h；然后將培養(yǎng)液在12000r/min、4℃、20min的條件下離心去除菌體，收集上清液即得右旋糖酐蔗糖酶粗酶液。

43號固體培養(yǎng)基配方為蔗糖130g/L、蛋白胨2.0g/L、KH₂PO₄0.3g/L、Na₂HPO₄1.4g/L、瓊脂20.0g/L，pH7.0-7.2；種子培養(yǎng)基配方為蔗糖50g/L、酵母膏10g/L、蛋白胨10g/L、KH₂PO₄0.3g/L、Na₂HPO₄1.4g/L，pH6.8；產酶培養(yǎng)基配方為蔗糖50g/L、酵母膏12.5g/L、牛肉膏20g/L、KH₂PO₄1.0g/L、Na₂HPO₄3.6g/L，pH7.0-7.2。

固體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌種的條件為25±3℃；種子培養(yǎng)基和產酶培養(yǎng)基培養(yǎng)菌種的條件為25±3℃、150±50r/min，裝液量是所盛容器標準容量的20%。

步驟(2)中PEG/Dextran雙水相體系構成為：粗酶液20mL，加入一定濃度的PEG溶液和外源性Dextran溶液，用無菌水補足至體系總質量為40g；PEG的分子量為6000，PEG6000的質量終濃度（w/w）為15%；外源性Dextran的分子量為1萬、4萬或7萬，Dextran-T10的質量終濃度（w/w）為0.8%～2.4%，Dextran-T40的質量終濃度（w/w）為0.8%～2.4%，Dextran-T70的質量終濃度（w/w）為0.4%～2.0%。