[發(fā)明專利]雙水相萃取快速分離純化右旋糖酐蔗糖酶的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310560298.7
• 申請日: 2013-11-12
• 公開（公告）號: CN103571806A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳山;劉玫;梁贏;張義平;姚曉麥;浦媛媛;鄒青松;黃磊;謝政;相萍萍
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西大學(xué)
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 45104
• 代理人: 楊立華

1.一種雙水相萃取快速分離純化右旋糖酐蔗糖酶的方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)用腸膜明串珠菌發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐蔗糖酶制備右旋糖酐蔗糖酶粗酶液；

(2)向步驟(1)的粗酶液中添加聚乙二醇和外源性葡聚糖構(gòu)建PEG/Dextran雙水相體系；

(3)將步驟(2)的PEG/Dextran雙水相體系低溫靜置分層和高速離心分離；

(4)將步驟(3)分離的下相透析濃縮即得右旋糖酐蔗糖酶。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙水相萃取快速分離純化右旋糖酐蔗糖酶的方法，其特征在于步驟(1)按以下操作進(jìn)行：將腸膜明串珠菌CICC21724在43號固體培養(yǎng)基斜面試管中復(fù)活后，接種至43號固體培養(yǎng)基；待長出茁壯的單菌落后，挑取2環(huán)單菌落接種至種子培養(yǎng)基；待菌種繁殖至對數(shù)期時，以2%的接種量接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基，培養(yǎng)20-26h；然后將培養(yǎng)液在12000r/min、4℃、20min的條件下離心去除菌體，收集上清液即得右旋糖酐蔗糖酶粗酶液。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙水相萃取快速分離純化右旋糖酐蔗糖酶的方法，其特征在于：所述43號固體培養(yǎng)基配方為蔗糖130g/L、蛋白胨2.0g/L、KH₂PO₄0.3g/L、Na₂HPO₄1.4g/L、瓊脂20.0g/L，pH7.0-7.2；所述種子培養(yǎng)基配方為蔗糖50g/L、酵母膏10g/L、蛋白胨10g/L、KH₂PO₄0.3g/L、Na₂HPO₄1.4g/L，pH6.8；所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方為蔗糖50g/L、酵母膏12.5g/L、牛肉膏20g/L、KH₂PO₄1.0g/L、Na₂HPO₄3.6g/L，pH7.0-7.2。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙水相萃取快速分離純化右旋糖酐蔗糖酶的方法，其特征在于：所述固體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌種的條件為25±3℃；所述種子培養(yǎng)基和產(chǎn)酶培養(yǎng)基培養(yǎng)菌種的條件為25±3℃、150±50r/min，裝液量是所盛容器標(biāo)準(zhǔn)容量的20%。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙水相萃取快速分離純化右旋糖酐蔗糖酶的方法，其特征在于步驟(2)中PEG/Dextran雙水相體系構(gòu)成為：粗酶液20mL，加入一定濃度的PEG溶液和外源性Dextran溶液，用無菌水補(bǔ)足至體系總質(zhì)量為40g；所述PEG的分子量為6000，PEG6000的質(zhì)量終濃度為15%；所述外源性Dextran的分子量為1萬、4萬或7萬，Dextran-T10的質(zhì)量終濃度為0.8%～2.4%，Dextran-T40的質(zhì)量終濃度為0.8%～2.4%，Dextran-T70的質(zhì)量終濃度為0.4%～2.0%。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的雙水相萃取快速分離純化右旋糖酐蔗糖酶的方法，其特征在于步驟(2)中盛放PEG/Dextran雙水相體系采用50mL的Beckman離心管。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的雙水相萃取快速分離純化右旋糖酐蔗糖酶的方法，其特征在于步驟(3)按以下操作進(jìn)行：構(gòu)建PEG/Dextran雙水相體系后，均勻混合，置于4℃的冰箱中靜置1h，然后利用高速冷凍離心機(jī)在12000r/min、4℃條件下離心20min后，倒掉上相，將下相用0.02mol/L?pH5.4的醋酸鈉緩沖液稀釋定容至15mL。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙水相萃取快速分離純化右旋糖酐蔗糖酶的方法，其特征在于步驟(4)中透析選用分子量為7000Da的透析袋。