[發(fā)明專利]植物中轉(zhuǎn)基因蛋白CP4-EPSPS的定量檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310560297.2
• 申請(qǐng)日: 2013-11-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103698418A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-04-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄧玉林;張玫
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京理工大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02
• 代理公司: 北京永瑞專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11450
• 代理人: 張慶敏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，具體地說(shuō)，涉及一種應(yīng)用同位素稀釋法與多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)策略聯(lián)合對(duì)植物中轉(zhuǎn)基因蛋白CP4-EPSPS定量檢測(cè)的方法。

背景技術(shù)

CP4-EPSPS基因業(yè)已廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物和植物。目前，包含30種不同植株的61%的轉(zhuǎn)基因作物/植物已在全球范圍內(nèi)12個(gè)國(guó)家內(nèi)被廣泛種植。隨著種植轉(zhuǎn)基因作物/植物的數(shù)量和品種在許多國(guó)家內(nèi)逐年遞增，轉(zhuǎn)基因作物/植物對(duì)人類健康和環(huán)境的影響越來(lái)越受到關(guān)注。因此，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物/植物中轉(zhuǎn)基因蛋白的定量技術(shù)逐漸成為研究熱點(diǎn)之一。

近年來(lái)，作物/植物中轉(zhuǎn)基因蛋白定量方法學(xué)的研究已成為研究熱點(diǎn)之一。常規(guī)的檢測(cè)方法包括實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)或者基于DNA和蛋白的免疫學(xué)檢測(cè)方法。實(shí)時(shí)定量PCR最初是由Applied?Biosystems公司于1996年開(kāi)發(fā)的。自此，該方法被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因DNA的測(cè)定。由于DNA相對(duì)而言較為脆弱，在加熱、存在核酸酶以及低pH值下均可能發(fā)生降解，而PCR方法學(xué)的可靠性又取決于DNA的完整性，因此該方法存在一定局限性。Western?blotting和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)也是可供選擇的定量方法。這些免疫學(xué)方法可以在蛋白水平上定量測(cè)定轉(zhuǎn)基因作物或植物中的轉(zhuǎn)基因蛋白，且具有較高靈敏、度通量等優(yōu)點(diǎn)。然而，這些方法均需要根據(jù)不同的目標(biāo)蛋白而使用不同抗體，這就為方法的廣泛應(yīng)用帶來(lái)了不小的挑戰(zhàn)。且由于在農(nóng)作物加工成食品的過(guò)程中有諸多因素存在，因此上述方法也無(wú)法應(yīng)用于加工食品中轉(zhuǎn)基因蛋白的檢測(cè)，這使得其應(yīng)用范圍受到了限制。此外，非特異性結(jié)合和交叉污染都可能降低基于免疫學(xué)的定量準(zhǔn)確度。

為了克服上述方法的局限，質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)方法被引入蛋白定量領(lǐng)域，該方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白在肽段水平上的定量檢測(cè)，與直接定量蛋白本身的方法相比具有更高的精密度。隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，MRM業(yè)已成為檢測(cè)小分子的常規(guī)方法，如：藥物代謝、激素、多肽和農(nóng)殘等。MRM是指，在電噴霧離子化后有兩個(gè)質(zhì)量選擇階段：選擇完整待測(cè)物質(zhì)的母離子，以及該母離子特異性碎裂產(chǎn)生的子離子。MRM方法會(huì)對(duì)待測(cè)物質(zhì)具產(chǎn)生特異性且靈敏度非常高的響應(yīng)，因此僅需將該方法與一維色譜分離結(jié)合就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)于待測(cè)物質(zhì)的子離子峰進(jìn)行積分的定量檢測(cè)。因此，基于質(zhì)譜的定量方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)特異性分析。而將MRM方法與同位素稀釋法聯(lián)合，可將一個(gè)相對(duì)定量的檢測(cè)提升為絕對(duì)定量。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種具有極高的靈敏度，可實(shí)現(xiàn)對(duì)CP4-EPSPS絕對(duì)定量的檢測(cè)方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

植物中轉(zhuǎn)基因蛋白CP4-EPSPS的定量檢測(cè)方法，先從植物中提取蛋白，得到蛋白粗提液；將蛋白粗提液進(jìn)行酶切，采用¹⁸O標(biāo)記3個(gè)CP4-EPSPS的特異性肽段作為內(nèi)標(biāo)，用UPLC/ESI-QQQ?MS檢測(cè)，在肽段水平上定量CP4-EPSPS；其中所述3個(gè)特異性肽段序列為ITGLLEGEDVINTGK（如SEQ?ID?NO.1所示）、SFMFGGLASGETR（如SEQ?ID?NO.2所示）和LAGGEDVADLR（如SEQ?ID?NO.3所示）。

所述提取蛋白時(shí)優(yōu)選采用pH7.6的Tris-HCl作為提取溶劑。

所述酶切時(shí)優(yōu)選采用胰蛋白酶酶切，酶切反應(yīng)時(shí)間為24h。其中蛋白:胰蛋白酶=50:1(w/w)。

其中¹⁸O標(biāo)記的過(guò)程優(yōu)選為：將特異性肽段樣品溶于用H₂¹⁸O配制的50mM?KH₂PO₄緩沖液中，隨后加入分別用H₂¹⁸O溶解的胰蛋白酶，其中蛋白:胰蛋白酶=50:1(w/w)，在37℃浴中標(biāo)記20h。

本發(fā)明的方法具有極高的靈敏度，可實(shí)現(xiàn)對(duì)于CP4-EPSPS的絕對(duì)定量。在本發(fā)明中，本發(fā)明采用煙葉被用作模式植物，因煙葉作為模式植物已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的轉(zhuǎn)基因作物/植物研究。本文建立的絕對(duì)定量方法，可以推廣至在其它作物或植物中對(duì)于轉(zhuǎn)基因蛋白含量的測(cè)定。