[發明專利]一種利用絮凝作用延長細菌發酵生產丁二酸周期的方法

在審

• 申請號: 201310559935.9
• 申請日: 2013-11-12
• 公開（公告）號: CN104630290A
• 公開（公告）日: 2015-05-20
• 發明（設計）人: 馬江鋒;方曉江;劉經偉;李澤壯;劉麗娟;王英武;陳韶輝;楊愛武
• 申請（專利權）人: 中國石油化工股份有限公司;中國石化揚子石油化工有限公司
• 主分類號: C12P7/46
• 分類號: C12P7/46;C12R1/19
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 黃嘉棟

技術領域

本發明涉及細菌發酵生產丁二酸的方法。

背景技術

丁二酸作為最重要的碳四平臺化合物，被廣泛應用于醫藥、農藥、染料、香料、油漆、食品和塑料等行業，同時可作為基礎原料，合成1,4-丁二醇，四氫呋喃，γ-丁內酯等有機化學品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)類生物可降解材料，具有巨大的市場潛力。采用生物法利用細菌發酵將二氧化碳固定，并將糖轉化為丁二酸的生物技術具有潛在的經濟和社會效益，包括：（1）采用生物發酵生產丁二酸的代謝路徑明確，代謝產物簡單，因此結晶產物丁二酸的純度高，不含有不飽和的二元酸和單酸，因此作為聚合單體質量高，而石化法丁二酸是在一系列催化劑作用下，經氧化、加氫、還原等步驟得到的，因此產品丁二酸中會含有微量的不飽二元酸和單酸，這些雜質對于丁二酸與二元醇聚合生產聚酯是不利的。（2）生物法丁二酸生產中每生產1t丁二酸，將會有0.37t的CO₂被菌體利用，有利于減少溫室氣體的排放。（3）生物合成丁二酸可利用可再生生物質資源，如各種植物秸稈廢棄物等作為生產原料，可利用豐富的農林生物質資源，確保生物基丁二酸不受石油價格波動的影響。（4）生物法制備丁二酸可以減少石油、煤等不可再生資源的消耗，達到節能減排的效果，為我國循環經濟的發展和綠色GDP增長作出重要貢獻。

大腸桿菌由于遺傳背景清楚、易操作、易調控、培養基要求簡單和生長迅速等優點，近年來被廣泛用于研究以獲得產丁二酸優秀菌株。

重組大腸桿菌在有氧條件下，菌體生長迅速，糖基原料主要通過三羧酸循環被消耗，并產生能量物質用于菌體細胞大量繁殖；在厭氧發酵條件下，菌體生長緩慢，主要通過還原三羧酸途徑和乙醛酸途徑積累有機酸。因此，目前利用重組大腸桿菌生長丁二酸過程中采用先有氧培養菌體后厭氧發酵產丁二酸的方法。Jiang等人在利用E.coli?AFP111兩階段發酵生產丁二酸過程中，厭氧階段丁二酸產物收率>90%，濃度>100g/L，生產速率達到1.8～2.5g/Lh（Applied?and?Environmental?Microbiology.2010,76(4):1298-1300），但若考慮有氧階段菌體培養的時間和消耗的碳源，丁二酸的的收率、濃度和生產速率均大幅下降。因此采用合適的方法回收細胞將可有效降低丁二酸的菌種成本，從而使總的生產成本得到有效控制。Ma等人在在利用E.coli?AFP111兩階段發酵生產丁二酸過程中，在兩階段發酵結束時通過離心的方法回收細胞并再次轉入新鮮培養基中厭氧發酵合成丁二酸（Biotechnology?Letter.2010,32(10):1413-1418）。但是離心過程細胞回收率一般只能在80%左右，而且離心過程的能耗相對較高，因此采用一種溫和、高效的細胞回收策略是重組大腸桿菌兩階段發酵產丁二酸過程需要解決的關鍵問題之一。

發明內容

本發明要解決的技術問題是在生產丁二酸重組大腸桿菌兩階段發酵結束時，通過一種溫和、高效的方法回收菌體細胞，并最終能夠轉入新鮮培養基中再次轉化合成丁二酸。

為實現本發明的技術目的，本發明采用以下技術方案：

一種利用絮凝作用延長細菌發酵生產丁二酸周期的方法，其包括下列步驟：

（1）菌種活化：從甘油凍存管中取少量菌液，在LB平板上劃線后放置于37℃下培養12h；

（2）種子液制備：從LB平板上取單菌落，接種于LB液體培養基，在37℃，200r/min條件下搖瓶培養6～8h，至菌體密度（OD₆₀₀）值在0.6～0.8之間；

（3）發酵產丁二酸過程：按3～10%的接種量接種發酵培養基，先同空氣有氧培養至菌體密度（OD₆₀₀）值在30～40之間，再以0.1～0.2vvm的通氣流量連續通二氧化碳氣體維持發酵罐中厭氧環境，并以碳酸鈉作為酸中和劑控制pH值在6.4～7.2，控制溫度在35～40℃；

（4）在一次厭氧發酵結束時，培養基中一次性添加絮凝劑，其使用總量在0.25～0.75g/L之間，然后停止發酵罐的攪拌，使發酵液靜置5～10分鐘后，用泵從預先插入發酵罐四分之三液位處的管子將發酵液抽出四分之三發酵液，發酵液中的細胞此時絕大多數沉在發酵罐的底部，隨后補入相同體積的新鮮培養基，開啟攪拌繼續發酵。如此循環3～5次。

上述的延長細菌發酵生產丁二酸周期的方法，步驟（1）所述的菌種是產丁二酸重組大腸桿菌。