[發明專利]一種水稻基因組DNA的提取方法在審

申請號：	201310559435.5	申請日：	2013-11-05
公開（公告）號：	CN103555712A	公開（公告）日：	2014-02-05
發明（設計）人：	梁衛紅;李佳佳;樓晨;林群婷;楊丹丹;王俊杰;郝雨帆	申請（專利權）人：	河南師范大學
主分類號：	C12N15/10	分類號：	C12N15/10
代理公司：	暫無信息	代理人：	暫無信息
地址：	453000 ***	國省代碼：	河南;41
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種水稻基因組 dna 提取方法
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【說明書】：

技術領域

本發明屬于生物領域，具體而言，涉及一種高純度、大片段水稻基因組DNA的簡易提取方法。

背景技術

水稻不僅是主要的糧食作物，而且是重要的模式生物。隨著水稻基因組研究的發展，分子生物學技術在水稻研究中得到廣泛地的應用。在水稻分子生物學研究中，提取和制備其DNA是許多研究工作的基礎和前提，例如：構建基因組文庫、Southern雜交、RFLP、PCR分離基因以及調控區等。在這些基于基因組DNA的操作中，對提取DNA的質量要求不僅包括高得率、高純度、完整性好且斷裂降解程度盡可能小，而且要盡量排除其他大分子，如蛋白質、多糖等的污染。由于一些植物組織材料中富含多糖和酚類物質，如果在DNA提取中未將其有效的去除，將抑制后續的操作，包括酶切、PCR反應，所以在DNA的抽提中，要應盡可能將其去除。

目前常用的水稻基因組DNA的提取方法主要有CTAB法和SDS法，在此基礎上，根據不同的實驗需要，還有一些衍生的簡易制備微量DNA方法的報道[3-11]。這些方法的原理是利用基因組DNA分子量遠遠大于細胞器DNA的特點，在破碎細胞后，通過有機試劑的多次抽提，將基因組DNA溶解在水相中，最后通過異丙醇或乙醇將其沉淀，達到分離提取的目的。根據實驗目的的不同，對提取DNA的質量和大小的要求也不同，例如：構建基因組文庫，初始DNA長度必須在100kb以上，否則酶切后兩邊都帶合適末端的有效片段就很少，獲得的基因組文庫的庫容就小，達不到覆蓋基因組全部遺傳信息的目的；如果是RFLP和PCR分析，DNA長度要達到50kb才可以滿足實驗需要。

現有的DNA提取方法，為去除蛋白質、多糖等大分子，需要在抽提過程中采用有機試劑多次處理、多次離心，而這樣的多步驟操作，勢必在提取過程中，不可避免的造成染色體DNA機械斷裂，產生大小不同的片段。因此，平衡好DNA純度和長度兩個因素是建立有效提取方法的關鍵。目前符合制備基因組文庫要求的、長度至少在100kb以上的高純度、大片段水稻基因組DNA的簡易制備方法還未見報道。

發明內容

由于提取高純度、大片段基因組DNA是許多分子生物學實驗的基礎和前提，現有的方法大多關注DNA的得率和操作的簡便性，對提取DNA的長度這一主要質量指標重視不足，導致不能滿足一些后續實驗，例如構建基因組文庫要求。本發明的目的是建立了一種簡便的、適合從水稻黃化苗中提取大片段基因組DNA的方法，這種既關注質量，也兼顧操作簡便的技術方法同樣適用于其他的植物材料。

為了實現本發明的目的，擬采用如下技術方案：

本發明一方面涉及一種水稻基因組DNA的提取方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)取新鮮水稻黃花苗材料液氮研磨，化凍前將粉末轉移至預熱至60-70℃的CTAB緩沖液中，輕輕轉動離心管，輕柔混勻，水浴保溫1-3h。

(2)將裂解混合物從水浴取出，冷卻至室溫后，加入0.8-1.2倍體積的氯仿／異戊醇，輕輕顛倒混合成乳濁液；

(3)室溫4500-5500rpm離心8-15min，將上層水相轉至新容器中，加1／1000-2／100體積的RNase?A溶液，輕柔顛倒混勻，36-38℃保溫20min-40min；

(4)加入0.6-0.8倍體積的異丙醇，待有白色絲狀物產生，收集白色絲狀物；

(5)將收集絲狀DNA用60％-80％乙醇洗滌2次；

(6)將洗滌后的DNA在室溫空氣干燥。

在本發明的一個優選實施方式中，所述的CTAB緩沖液的pH值為7.9-8.1之間，包括Tris-HCl緩沖溶液，EDTA，NaCl以及CTAB，使用前加入0.2％B-巰基乙醇。

在本發明的另一個優選實施方式中，所述的氯仿／異戊醇的體積比是24：1。

在本發明的一個優選實施方式中，所述的RNase?A的濃度為8-20mg／mL。

本發明建立了一種簡易有效的水稻大片段基因組DNA的提取技術，與現有的技術相比，能簡化操作步驟，減少離心次數和轉速，減少所需試劑的數量，DNA的質量完全可以滿足包括基因組文庫構建、基因組序列擴增、Southern?blot，TAIL-PCR等在內的常見后續實驗的要求。