[發明專利]一種雙功能配體靶向樹突狀細胞腫瘤疫苗及其制備方法

有效

• 申請號: 201310557996.1
• 申請日: 2013-11-11
• 公開（公告）號: CN104623646B
• 公開（公告）日: 2018-05-18
• 發明（設計）人: 盧小玲;趙永祥;賴春慧
• 申請（專利權）人: 廣西醫科大學
• 主分類號: A61K39/00
• 分類號: A61K39/00;A61K47/24;A61K47/26;A61K9/127;A61P35/00
• 代理公司: 深圳市順天達專利商標代理有限公司 44217
• 代理人: 郭偉剛;周嬌嬌

本發明涉及一種雙功能配體靶向樹突狀細胞的腫瘤疫苗及其制備方法，該方法包括以下步驟：S1、制備甘露糖修飾的納米脂質體；S2、將CpG?ODN連接至納米脂質體上得到雙功能配體修飾的納米脂質體；S3、通過反復融凍法從腫瘤細胞中提取出腫瘤抗原肽；S4、通過凍干?再水化法將腫瘤抗原肽包裹進所述功能配體修飾的納米脂質體內。本發明采用雙功能配體修飾的納米脂質體作為載體，脂質體表面的甘露糖分子能特異性靶向至樹突狀細胞，CpG?ODN則結合于樹突狀細胞內的Toll樣受體9，促進樹突狀細胞成熟，成熟的樹突狀細胞能高效遞呈納米脂質體內部釋放出的腫瘤抗原肽，激活T淋巴細胞，產生特異性抗腫瘤作用。

技術領域

本發明屬于生物材料的醫學基礎應用領域，更具體地說，涉及一種雙功能配體靶向樹突狀細胞（DC）腫瘤疫苗及其制備方法。

背景技術

腫瘤是嚴重危害人類健康的重大疾病之一。雖然傳統方法如手術切除、局部或全身化療和放療等方法取得了一定的進展，但是仍然需要探索新的抗腫瘤方法。

樹突狀細胞（DC）是目前研究已知的體內能力最強的專職抗原提呈細胞（APC），也是唯一能誘導初次免疫應答和激活未致敏T細胞的APC。DC作為抗原特異性免疫應答的始動者，在機體的抗腫瘤免疫反應中發揮著核心的作用。腫瘤浸潤組織中DC誘導免疫效應細胞的能力較低，這是因為在腫瘤的發生發展過程中，DC的成熟不僅受到腫瘤細胞死亡方式的影響，而且壞死的腫瘤細胞核晚期凋亡的腫瘤細胞僅給DC輸送了部分成熟信號，腫瘤細胞產生的可溶性因子也會對DC的成熟和功能起到抑制作用。探索新的方法靶向有效激活體內的抗原提呈細胞產生抗腫瘤效應有重要的科學意義和潛在的應用前景。

腫瘤的免疫治療是近年來興起的最有前景的治療方法，其最大的優點處在于激發、增強機體的特異性免疫反應，加強免疫系統的自我調節能力，從而達到延緩和降低腫瘤復發轉移的目的。腫瘤主動性免疫治療是指利用腫瘤細胞或腫瘤特異性抗原物質或者免疫佐劑等誘導機體產生特異性免疫，進而主動殺傷腫瘤細胞。但是輸注進體內的腫瘤抗原肽或者佐劑缺乏靶向性和免疫原性弱等問題，無法強有效地刺激機體產生特異性的抗腫瘤作用。

發明內容

本發明要解決的技術問題在于，針對現有腫瘤主動免疫治療中腫瘤抗原肽疫苗靶向性弱、抗原刺激性低下的問題，提供一種雙功能配體靶向DC的腫瘤疫苗及其制備方法。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：提供了一種雙功能配體靶向樹突狀細胞的腫瘤疫苗的制備方法，包括以下步驟：

S1、將棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿、膽固醇、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、雙十二烷基二甲基溴化銨、軟脂酸-甘露糖酯、α-生育酚按照摩爾比為49.8：40：5：3：2：0.2的比例混合后，通過真空旋轉蒸發后干燥，再重懸過濾得甘露糖修飾的納米脂質體；

S2、使用磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-馬來酰亞胺制備膠束液，將CpG-寡聚脫氧核苷酸溶液加入所述膠束液中，在氮氣氛圍中反應30-60分鐘，加入與磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-馬來酰亞胺等摩爾的β-半胱胺，孵育30-60分鐘；隨后將孵育液加入步驟S1制得的甘露糖修飾的納米脂質體的溶液中，反應30-45分鐘，得到雙功能配體修飾的納米脂質體；

S3、通過反復融凍法從腫瘤細胞中提取腫瘤抗原肽；

S4、通過凍干-再水化法將腫瘤抗原肽包裹進所述功能配體修飾的納米脂質體內得雙功能配體靶向樹突狀細胞的腫瘤疫苗。

在根據本發明所述的雙功能配體靶向樹突狀細胞的腫瘤疫苗的制備方法中，所述步驟S1中真空旋轉蒸發的轉速為200rpm/min，時間為10-20分鐘，水浴溫度為40度，所述干燥的時間為2-4小時，所述重懸采用4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液水浴超聲5-10分鐘，所述過濾中采用孔徑為200nm、100nm和50nm的聚碳酸酯膜。