[發(fā)明專利]一種寡核苷酸文庫(kù)修飾的顆粒及其制備和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310557895.4
• 申請(qǐng)日: 2013-11-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104634915A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-05-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張麗華;鄧楠;梁振;朱貴杰;楊開(kāi)廣;張玉奎
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
• 主分類號(hào): G01N30/89
• 分類號(hào): G01N30/89
• 代理公司: 沈陽(yáng)科苑專利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理，具體地說(shuō)是一種寡核苷酸文庫(kù)修飾的顆粒及其在蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

生物樣品內(nèi)蛋白質(zhì)的組成極其復(fù)雜，而且動(dòng)態(tài)范圍比較寬，濃度差異大（豐度差異大），比如血漿樣品中前10種高豐度蛋白質(zhì)含量占到總蛋白質(zhì)含量的90%，前22種蛋白質(zhì)占到99%，余下幾千種蛋白卻僅占到1%，高豐度蛋白質(zhì)的存在會(huì)掩蓋低豐度蛋白質(zhì)，從而干擾對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的鑒定，而這些低豐度蛋白質(zhì)往往存在潛在的生物學(xué)意義，在疾病標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)與治療方面可能會(huì)發(fā)揮重要生物功能（J.Proteome?Res.,2011,10,5–16）。因此在蛋白質(zhì)樣品分析過(guò)程中需要降低其中高豐度蛋白質(zhì)的豐度差別，縮小這種差異以方便用現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)到低豐度蛋白質(zhì)成為蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理的核心問(wèn)題之一。

目前發(fā)展的去除高豐度蛋白質(zhì)的技術(shù)方法主要包括染料配體法、超速離心過(guò)濾法、免疫去除法及預(yù)分級(jí)技術(shù)。染料配體法是將汽巴藍(lán)F3GA及其衍生物固定在聚甲基丙烯酸縮水甘油酯顆粒表面，通過(guò)染料跟白蛋白的相互作用去除人血清白蛋白(Journal?of?Chromatography?B,2006,832,216-223)。該方法樣品的處理量大，但特異性較差。超速離心過(guò)濾法主要通過(guò)選擇具有不同截留分子量的膜實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離，并去除某些分子量較大的高豐度蛋白質(zhì)（Molecular?&?Cellular?Proteomics,2003,2,1096–1103）。然而高豐度蛋白質(zhì)并非都是大分子量的蛋白質(zhì)，因此會(huì)存在對(duì)高豐度蛋白質(zhì)去除不充分，而且可能會(huì)同時(shí)去除高分子量的低豐度蛋白質(zhì)等問(wèn)題。與前兩種去除方法相比，免疫去除法的特異性很高(Mol?Cell?Proteomics2008,7,1963-1973;J?Proteome?Res2010,9,4982-4991;J?Proteome?Res.,2007,6,947-954)。然而，該方法仍存在很多不足，如，低豐度蛋白質(zhì)易與部分高豐度蛋白質(zhì)非特異性結(jié)合，產(chǎn)生共去除現(xiàn)象(Electrophoresis2010,31,471-482)；已發(fā)現(xiàn)的抗體種類少(20種)；處理樣品的體積有限；去除后的樣品被稀釋；不同蛋白質(zhì)去除效率有一定差異性等。近期，人們還通過(guò)采用液相等電聚焦和多維液相色譜等方法進(jìn)行樣品的預(yù)分級(jí)，有效地降低了樣品的復(fù)雜程度(J.ProteomeRes.,2009,8,1143–1155;Electrophoresis,2009,30:249-261;Electrophoresis,2010,31,3580–3585;J.Proteome?Res.,2009,8,1143–1155;J.Proteome?Res.,2010,9,1902-1912)。但是液相等電聚焦方法只能根據(jù)已有的等電點(diǎn)膜將樣品按照有限的等電點(diǎn)區(qū)間進(jìn)行分級(jí)。因此，高豐度蛋白質(zhì)所在級(jí)分仍存在對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的掩蓋問(wèn)題。而多維液相色譜方法不僅操作繁瑣、運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng)，而且也難以避免去除高豐度蛋白質(zhì)的同時(shí)造成低豐度蛋白質(zhì)的共洗脫。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)以上方法目前存在的不足，本發(fā)明提供一種簡(jiǎn)便高效的蛋白質(zhì)樣品處理方法以降低蛋白質(zhì)樣品中高豐度蛋白質(zhì)的豐度。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

采用寡核苷酸文庫(kù)修飾的顆粒處理蛋白質(zhì)樣品，并依次采用氯化鈉溶液,甘氨酸溶液，尿素溶液及十二烷基磺酸鈉溶液分別對(duì)顆粒上的蛋白質(zhì)進(jìn)行洗脫，以降低蛋白質(zhì)樣品中高豐度蛋白質(zhì)的豐度，縮小蛋白質(zhì)樣品內(nèi)高豐度蛋白質(zhì)與低豐度蛋白質(zhì)的豐度差異。

所述寡核苷酸文庫(kù)修飾的顆粒的制備與蛋白質(zhì)樣品處理的具體步驟如下，

（1）寡核苷酸文庫(kù)的修飾：

a.磁性基質(zhì)顆粒：將寡核苷酸文庫(kù)溶液與磁性顆粒以0.2-10nmol/mg的比例在三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液（Tris-HCl）中室溫條件下反應(yīng)0.5-12h。

b.聚丙烯酸酯基質(zhì)材料：將寡核苷酸文庫(kù)溶液與功能化的聚丙烯酸酯基質(zhì)材料以0.5-250nmol/mg的比例在磷酸緩沖溶液中室溫條件下反應(yīng)6-24h。

c.金顆粒：將寡核苷酸文庫(kù)溶液與金顆粒以摩爾數(shù)為50:1的比例在水溶液中室溫條件下反應(yīng)6-24h。

（2）蛋白質(zhì)樣品的處理：采用（1）制備的顆粒與蛋白質(zhì)樣品在1-10℃條件下孵育0.5-10h。