[發明專利]一種海豚鏈球菌DNA疫苗及其應用

有效

• 申請號: 201310557674.7
• 申請日: 2013-11-11
• 公開（公告）號: CN103550765A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 孫黎;孫云;孫鉑光
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: A61K39/09
• 分類號: A61K39/09;A61P31/04;C12N15/85;C12N15/66;C12R1/46
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術領域

本發明涉及免疫學領域，具體的說是一種海豚鏈球菌DNA疫苗及其應用。

背景技術

海豚鏈球菌（Streptococcus?iniae）為一種革蘭氏陽性菌，屬于鏈球菌屬，是養殖魚類主要病原菌之一。在我國，海豚鏈球菌危害的魚類包括羅非魚、牙鲆、美國紅魚、鯛類等。除了水生動物外，海豚鏈球菌還能夠感染人類和其它動物，是一種典型的人畜共患病原，其感染人類后可造成各種軟組織炎癥以及敗血癥等。在我國，至今沒有商業化海豚鏈球菌疫苗，對海豚鏈球菌相關病害的防治一直以抗生素和化學藥物為主。

發明內容

本發明目的在于提供一種海豚鏈球菌DNA疫苗及其應用。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

一種海豚鏈球菌DNA疫苗,疫苗為pCNSiE。

具體為：

以海豚鏈球菌G26為模板經引物F1/R1進行PCR擴增，擴增產物與載體pCN3質粒連接轉化后質粒pCNSiE，即為海豚鏈球菌DNA疫苗；

所述引物序列為：

F1：5’-CCCGGGATGATTTTTGGAAAAAGTAGTAATGGA-3；

R1：5’-CCCGGGCCTTCTTACCTTTGACTGAT-3’。

所述質粒pCNSiE在PBS中稀釋至終濃度為150μg/ml，作為疫苗制備液。所述疫苗為注射劑。

一種海豚鏈球菌DNA疫苗的制備方法,以海豚鏈球菌G26為模板，采用F1/R1為引物進行PCR擴增,PCR產物純化后與用Sma?I酶切的質粒pCN3連接，連接液轉化到大腸桿菌DH5α后在含有氨芐青霉素的LB培養基上培養18－24小時，接轉化后質粒為pCNSiE，即為海豚鏈球菌DNA疫苗質粒。

一種海豚鏈球菌DNA疫苗的應用,所述質粒pCNSiE用于制備海豚鏈球菌的免疫疫苗中的應用。

本發明具有如下優點：

1.高保護率。本發明的疫苗對海豚鏈球菌的免疫保護效率達95％。

2.長效。本發明的疫苗在免疫后兩個月內的免疫保護效率沒有明顯減弱。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步說明。實施例旨在對本發明進行舉例描述，而非以任何形式對本發明進行限制。

在本發明實施例中所涉及到的常規性實驗方法均采用如下方法：

1.質粒提取、DNA(PCR)產物純化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相應試劑盒。

2.質粒、DNA連接液轉化進入大腸桿菌皆用Hanahan方法（Sambrook?and?Russell:Molecular?Cloning:A?Laboratory?Mannual.Cold?Spring?Harbor?Laboratory?Press?2001）；

3.所有限制性內切酶和連接酶皆購自于“北京，紐英倫生物技術有限公司”。

實施例1

DNA疫苗質粒pCNSiE的構建：

以海豚鏈球菌G26為模板，采用F1/R1為引物進行PCR擴增,PCR條件為：94℃60s預變性模板DNA,然后94℃40s,52℃60s,72℃60s,5個循環后改為94℃40s,63℃60s,72℃60s,25個循環后再在72℃延伸反應10min。PCR產物用天根DNA產物純化試劑盒純化。將質粒pCN3（pCN3構建過程參見Jiao?XD,Zhang?M,Hu?YH,Sun?L.Construction?and?evaluation?of?DNA?vaccines?encoding?Edwardsiella?tarda?antigens.Vaccine?2009;27:5195?202.）用Sma?I酶切，回收5.4kb片段，將其與上述純化的PCR產物用T4DNA連接酶于室溫連接2－4小時，連接液轉化大腸桿菌DH5α后在含氨芐青霉素(100ug/ml)的LB固體培養基上培養18－24小時,篩選轉化子提取質粒，即為pCNSiE。

PCR引物為F1：5’-CCCGGGATGATTTTTGGAAAAAGTAGTAATGGA-3’和R1：5’-CCCGGGCCTTCTTACCTTTGACTGAT-3’。