[發明專利]一種快速檢測五種β-地中海貧血突變的試劑盒及其應用

無效

• 申請號: 201310556987.0
• 申請日: 2013-11-11
• 公開（公告）號: CN103602736A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發明（設計）人: 尹愛華;張彥;何天文;陳漢彪;杜麗
• 申請（專利權）人: 廣東省婦幼保健院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運貞;裘暉

1.一種快速檢測五種β-地中海貧血突變的試劑盒，其特征在于包括-28位點引物對、CDs41/42和CDs71/72位點引物對、CD17位點引物對和IVS-Ⅱ-654位點引物對：

-28位點引物對：

上游引物為：5’-CCAATCTACTCCCAGGAGCA-3’；

下游引物為：5’-ACTTCTCCTCAGGAGTCAGGT-3’；

CDs41/42和CDs71/72位點引物對：

上游引物為：5’-GAAGACTCTTGGGTTTCTGA-3’；

下游引物為：5’-AGAAAACATCAAGGGTCCCA-3’；

CD17位點引物對：

上游引物為：5’-AGACACCATGGTGCACCTGAC-3’；

下游引物為：5’-GGCAGAGAGAGTCAGTGCCTA-3’；

IVS-Ⅱ-654位點引物對：

上游引物為：5’-GTGTACACATATTGACCAAATCAGGGTA-3’；

下游引物為：5’-GGTAGCTGGATTGTAGCTGC-3’。

2.根據權利要求1所述的快速檢測五種β-地中海貧血突變的試劑盒，其特征在于：所述的試劑盒將-28位點引物對及CDs41/42和CDs71/72位點引物對按1:1的比例在放置在一起，CD17位點引物對、IVS-Ⅱ-654位點引物對分別放置。

3.根據權利要求1所述的快速檢測五種β-地中海貧血突變的試劑盒，其特征在于：所述的試劑盒還包含Taq?DNA聚合酶、dNTP、染料、MgCl₂、PCR緩沖液、水和對照模板；

所述的染料為SYBR?Green?I；

所述的水為雙蒸水或超純水；

所述的對照模板包括正常樣本和已知陽性對照突變位點樣本。

4.根據權利要求3所述的快速檢測五種β-地中海貧血突變的試劑盒，其特征在于：所述的正常樣本為經測序證實的無β-珠蛋白基因突變的人DNA模板樣本；

所述的已知陽性對照突變位點樣本為-28、CD17、CDs41/42、CDs71/72、IVS-Ⅱ-654位點突變的純合子及雜合子的人的陽性DNA模板。

5.根據權利要求1所述的快速檢測五種β-地中海貧血突變的試劑盒，其特征在于：含有-28位點引物對、CDs41/42和CDs71/72位點引物對、CD17位點引物對、IVS-Ⅱ-654位點引物對、2倍濃度的Master?Mix、MgCl₂、水和對照模板；

所述的2倍濃度的Master?Mix為羅氏制藥有限公司生產的LightCycler480High?Resolution?Melting?Master中的濃度為2×conc.的Master?Mix，其中含有Taq?DNA聚合酶、PCR緩沖液、dNTP和染料。

6.一種應用上述試劑盒進行快速檢測五種β-地中海貧血突變的使用方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）抽提樣本基因組DNA，制備DNA模板；

（2）配制反應體系，具體如下：取3個PCR反應管，PCR反應管1中加入-28位點的引物對及CDs41/42和CDs71/72位點的引物對、DNA模板、2倍濃度的Master?Mix、MgCl₂和水；PCR反應管2中加入CD17位點的引物對、DNA模板、2倍濃度的Master?Mix、MgCl₂和水；PCR反應管3中加入IVS-Ⅱ-654位點的引物對、DNA模板、2倍濃度的Master?Mix、MgCl₂和水；

（3）分別用步驟（2）配制的反應體系進行PCR擴增，分別得到相應的PCR產物，同時擴增含有對照模板的反應體系；

（4）將步驟（3）得到的PCR產物使用LightCycler480進行高分辨率熔解曲線分析；

（5）結果判斷:以無β-珠蛋白基因突變的正常樣本曲線作為基線，得到對應的熔解曲線圖，與陽性對照突變位點熔解曲線圖進行比對從而確定是否存在突變，熔解曲線形狀與已知陽性對照突變位點熔解曲線圖不一致的，需重新檢測或者測序明確基因型。