[發(fā)明專利]戊型肝炎病毒抗體檢驗通用ELISA法及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310556500.9
• 申請日: 2013-11-11
• 公開（公告）號: CN103837681A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發(fā)明（設計）人: 張桂紅;王衡;梁煥斌;寧章勇;古洪浪;紀方曉
• 申請（專利權）人: 華南農業(yè)大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 任重

技術領域

本發(fā)明涉及一種病毒抗體檢驗方法，尤其涉及一種人、豬戊型肝炎病毒抗體檢驗通用ELISA法及其應用。

背景技術

戊型肝炎是引起爆發(fā)性及散發(fā)性肝炎的主要原因，血清學調查表明，世界1/3人口曾經感染過戊型肝炎病毒(Hepatitis?E?virus,?HEV)。無論是在發(fā)展中國家還是在發(fā)達國家，戊型肝炎都不再是一種罕見的疾病，在發(fā)達國家每年約有1.3萬-2.6萬人慢性肝炎患者因合并HE死亡。戊型肝炎具有比較明顯的年齡特異性，對于老年人、慢性肝炎患者及孕婦危害性尤高，孕婦感染HEV的死亡率可達20%。眾多研究表明，豬HEV可能是人感染HEV的主要來源之一，因此，積極開展動物源性HEV的研究將會對公共衛(wèi)生及動物源性食品安全的實施具有巨大的幫助。??????

????目前在我國大部分地區(qū)，不但在人群中可以檢驗到高比例存在的HEV陽性血清，同時在家畜（豬、馬、牛、羊）及寵物（犬）體內同樣可以發(fā)現高比例的HEV陽性血清，特別是在豬群中感染率尤為明顯。通過對我國分離到的病毒遺傳物質測序比對發(fā)現，無論是人源還是動物源的HEV大多數屬于IV型。而且對我國東部及南部的分離株分析發(fā)現，豬HEV與人HEV具有較高的相似性。因此有學者推測，豬可能是HEV重要的儲存器，并通過污染水源和食品，作為一種人獸共患病原在豬群及人群中自由傳播。

發(fā)明內容???

本發(fā)明的目的在于提供一種人、豬以及多種動物戊型肝炎病毒抗體檢驗通用ELISA法。

發(fā)明通過以下技術方案實現上述目的。

本發(fā)明提供一種人、豬戊型肝炎病毒抗體檢驗通用ELISA法，具體為一種單抗阻斷ELISA法，所述的單抗阻斷ELISA法中使用豬戊型肝炎病毒的ORF3重組蛋白作為包被抗原。

????包括以下步驟：

S1.?包被抗原：用包被液將ORF3重組蛋白稀釋加入酶標板孔中，靜置；

S2.?封閉：將步驟S1的酶標板用PBST洗板，加入封閉液，在35~39℃封閉；

S3.?加樣：將步驟S2所得的酶標板棄液清洗，將待檢血清稀釋并加入到清洗后的酶標板中，反應；

S4.?加入酶標抗體：將HRP標記的ORF3單克隆抗體稀釋加入到步驟S3所得的酶標板中，反應；

S5.?顯色：將底物加入到步驟S4所得酶標板中，顯色反應；

S6.?終止及測定：在步驟S5所得的酶標板中加入終止液，測定OD490nm值。

優(yōu)選地，該單抗阻斷ELISA法包括以下步驟：

S1.?包被抗原：用包被液將ORF3重組蛋白稀釋至0.5~10μg/100μL，以每孔100μL的量加入酶標板孔中，4℃靜置12h；同時設置抗原空白對照孔；

S2.?封閉：棄去板孔中的液體，PBST洗板5次，每次3min，每孔加入封閉液200μL，37℃作用1~4h；

S3.?加樣：棄去板孔中的液體、洗板，待檢血清事先以待檢血清與PBST按?1:1~1:200的體積比例進行稀釋，然后向酶標板每孔中加入稀釋后的待檢血清100μL，37℃作用60?min；

S4.?加入酶標抗體：棄去板孔中的液體、洗板，每孔加入HRP標記的ORF3單克隆抗體100μL，HRP標記的ORF3單克隆抗體事先用PBST稀釋至濃度為10^-7~10^-3mg/mL，37℃作用60?min；

S5.?顯色：棄去板孔中的液體、洗板，每孔加入底物溶液100μL，室溫避光作用10~25?min；?

S6.?終止及測定：每孔加入2?mol/LH₂SO_4?50μL終止反應，測定OD490nm值，記錄結果。

優(yōu)選地，S1中包被液為pH=9.6，0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，ORF3重組蛋白被包被液稀釋至1μg/100μL。

優(yōu)選地，S2中封閉液為2%?BSA，封閉的作用時間為2h。

優(yōu)選地，S2中待檢血清事先用以待檢血清與PBST按1:10的體積比例進行稀釋，S3中HRP標記的ORF3單克隆抗體事先用PBST稀釋至濃度為10^-5mg/mL。

優(yōu)選地，S5中底物溶液為TMB底物溶液，顯色的作用時間為20min。

????優(yōu)選地，還包括步驟S7：