[發明專利]戊型肝炎病毒抗體檢驗通用ELISA法及其應用

有效

• 申請號: 201310556500.9
• 申請日: 2013-11-11
• 公開（公告）號: CN103837681A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發明（設計）人: 張桂紅;王衡;梁煥斌;寧章勇;古洪浪;紀方曉
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 任重

1.?一種戊型肝炎病毒抗體檢驗通用ELISA法，其特征在于，所述通用ELISA法為單抗阻斷ELISA法，所述單抗阻斷ELISA法中使用豬戊型肝炎病毒的ORF3重組蛋白作為包被抗原。

2.?根據權利要求1所述的戊型肝炎病毒抗體檢驗通用ELISA法，其特征在于，包括以下步驟：

S1.?包被抗原：用包被液將ORF3重組蛋白稀釋加入酶標板孔中，靜置；

S2.?封閉：將步驟S1的酶標板用PBST洗板，加入封閉液，在35~39℃封閉；

S3.?加樣：將步驟S2所的酶標板棄液清洗，將待檢血清稀釋并加入到清洗后的酶標板中，反應；

S4.?加入酶標抗體：將HRP標記的ORF3單克隆抗體稀釋加入到步驟S3所得的酶標板中，反應；

S5.?顯色：將底物加入到步驟S4所得酶標板中，顯色反應；

S6.?終止及測定：在步驟S5所得的酶標板中加入終止液，測定OD490nm值。

3.?根據權利要求2所述的戊型肝炎病毒抗體檢驗通用ELISA法，其特征在于，包括以下步驟：

????S1.?包被抗原：用包被液將ORF3重組蛋白稀釋至0.5~10μg/100mL，以每孔100μL的量加入酶標板孔中，4℃靜置12h；同時設置抗原空白對照孔；

????S2.?封閉：棄去板孔中的液體，PBST洗板5次，每次3min，每孔加入封閉液200μL，37℃作用1~4h；

????S3.?加樣：棄去板孔中的液體、洗板，事先將待檢血清與PBST按1:1~1:200的體積比例進行稀釋，然后向酶標板每孔中加入稀釋后的待檢血清100μL，37℃作用60?min；

????S4.?加入酶標抗體：棄去板孔中的液體、洗板，每孔加入HRP標記的ORF3單克隆抗體100μL，HRP標記的ORF3單克隆抗體事先用PBST稀釋至濃度為10^-7~10^-3mg/mL，37℃作用60?min；

????S5.?顯色：棄去板孔中的液體、洗板，每孔加入底物溶液100μL，室溫避光作用10~25?min；?

????S6.?終止及測定：每孔加入2?mol/LH₂SO₄?50μL終止反應，測定OD490nm值，記錄結果。

4.?根據權利要求3所述的戊型肝炎病毒抗體檢驗通用ELISA法，其特征在于，S1中包被液為pH=9.6，0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，ORF3重組蛋白被包被液稀釋至1μg/100μL。

5.?根據權利要求3所述的戊型肝炎病毒抗體檢驗通用ELISA法，其特征在于，S2中封閉液為2%BSA，封閉的作用時間為2h。

6.?根據權利要求3所述的戊型肝炎病毒抗體檢驗通用ELISA法，其特征在于，S3中待檢血清事先將待檢血清與PBST按1:10的體積比例進行稀釋，S4中HRP標記的ORF3單克隆抗體事先用PBST將其濃度稀釋至10^-5mg/mL。

7.?根據權利要求3所述的戊型肝炎病毒抗體檢驗通用ELISA法，其特征在于，S5中底物溶液為TMB底物溶液，顯色的作用時間為20min。

8.?根據權利要求2或3所述的戊型肝炎病毒抗體檢驗通用ELISA法，其特征在于，還包括步驟S7：

????S7.?根據步驟?S6測定的OD490nm值，將計算阻斷率，當阻斷率?≤?53.1時，判斷為陽性；當阻斷率?≥?58.3，判斷為陰性；當53.1?<阻斷率<?58.3時，判定為疑似，需要重新檢查一次。

9.?根據權利要求1-8中任一項所述的戊型肝炎病毒抗體檢驗通用ELISA法在人或動物戊型肝炎病毒抗體檢驗試劑中的應用。

10.?根據權利要求1-8中任一項所述的戊型肝炎病毒抗體檢驗通用ELISA法的應用，其特征在于，用于人、豬戊型肝炎病毒抗體的檢驗。