[發明專利]亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法

有效

• 申請號: 201310555189.6
• 申請日: 2013-11-11
• 公開（公告）號: CN103601796A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發明（設計）人: 王喆明
• 申請（專利權）人: 杭州璞題生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C07K1/107;C12N15/70
• 代理公司: 杭州華知專利事務所 33235
• 代理人: 寧岡

技術領域

本發明涉及一種蛋白質的化學修飾，具體涉及一種亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法。

背景技術

蛋白質修飾是一個復雜的過程，在真核生物中修飾類型很多，常見的有棕櫚化、乙酰化、泛素化、磷酸化和SUMO化，蛋白質修飾能夠改變蛋白質的活性、定位或功能。蛋白質的棕櫚化修飾是指16個碳的脂肪酸棕櫚酸鹽通過硫酯鍵共價結合到蛋白質特定的半胱氨酸殘基側鏈上，這對不同膜蛋白及膜蛋白信號通路的功能調節非常重要。

亨廷頓舞蹈病(Huntington?disease，HD)是一種常染色體顯性遺傳的神經變性疾病，?HD基因編碼一個由3144個氨基酸組成的亨廷頓蛋白(Huntingtin，Htt)，從Htt氨基酸末端第17位開始有一段重復的谷氨酰胺(CAG)序列。CAG重復序列將產生兩個直接結果：一是使野生型亨廷頓蛋白(wild?huntingtin，wHtt)缺失，二是產生突變型亨廷頓蛋白(mutant?Htt，mHtt)。隨著多聚谷氨酰胺的過度延長，Htt蛋白會在轉谷氨酰胺酶的作用下發生交聯而形成聚集體，在主鏈和側鏈酰胺基之間氫鍵連接的作用下，多聚谷氨酰胺序列可形成多聚物，稱為多聚谷氨酰胺序列(PolyQ)。正常人的PolyQ長度小于35個，而HD患者的PolyQ長度會超過37個。這些異常蛋白質積聚成塊，損壞部分腦細胞，特別是那些與肌肉控制有關的細胞，導致患者神經系統逐漸退化，神經沖動彌散，動作失調，出現不可控制的顫搐，并能發展成癡呆，甚至死亡。臨床表現主要為舞蹈樣不自主動作、精神障礙和進行性癡呆。

Htt的214位半胱氨酸可由位于高爾基體的棕櫚酰轉移酶相關蛋白14(HIP14)棕櫚酰化。HIP14的過量表達會導致內源性Htt的重新分配，并且能夠在一定程度上將mHtt也分配到質膜中，而沒有被棕櫚酰化的Htt不能被重新分配，這種現象表明Htt重新分配到質膜是由棕櫚酰化作用來調節的。相反，當PolyQ?中的Htt棕櫚酰化位點突變從而沒有棕櫚酰化時加劇了其細胞毒性，致使蛋白聚合和細胞死亡。

發明內容

針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法，通過對亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾，主要是Ser和Thr的O-連接棕櫚化，顯示出蛋白的穩定性增加，棕櫚化蛋白有對抗水解酶的能力，顯示出棕櫚化蛋白有較強的穩定性，因此研究亨廷頓蛋白的棕櫚化對亨廷頓疾病的治療有重要意義。

本發明的目的可通過下列技術方案來實現：一種亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法，包括以下步驟：（1）、獲取重組蛋白Htt（1-90）：a、亨廷頓蛋白基因的獲得；b、重組表達質粒pTWIN1-htt的構建；c、表達亨廷頓蛋白的重組大腸桿菌菌株DH5α-htt的構建；d、重組蛋白的表達；（2）、重組蛋白Htt（1-90）的純化；（3）、SPPS方法獲得棕櫚化修飾的Htt（Cys-K92-K158）多肽；（4）Htt（Cys-K92-K158）多肽的純化；（5）Htt（Cys-K92-K158）多肽與重組蛋白Htt（1-90）經過偶聯獲得經棕櫚化修飾目的蛋白Htt（1-158）；（6）經棕櫚化修飾目的蛋白Htt（1-158）的純化。