[發明專利]亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法

有效

• 申請號: 201310555189.6
• 申請日: 2013-11-11
• 公開（公告）號: CN103601796A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發明（設計）人: 王喆明
• 申請（專利權）人: 杭州璞題生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C07K1/107;C12N15/70
• 代理公司: 杭州華知專利事務所 33235
• 代理人: 寧岡

1.一種亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法，其特征在于，包括以下步驟：（1）、獲取重組蛋白Htt（1-90）：a、亨廷頓蛋白基因的獲得；b、重組表達質粒pTWIN1-htt的構建；c、表達亨廷頓蛋白的重組大腸桿菌菌株DH5α-htt的構建；d、重組蛋白的表達；（2）、重組蛋白Htt（1-90）的純化；（3）、SPPS方法獲得棕櫚化修飾的Htt（Cys-K92-K158）多肽；（4）Htt（Cys-K92-K158）多肽的純化；（5）Htt（Cys-K92-K158）多肽與重組蛋白Htt（1-90）經過偶聯獲得經棕櫚化修飾目的蛋白Htt（1-158）；（6）經棕櫚化修飾目的蛋白Htt（1-158）的純化。

2.根據權利要求1所述的亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法，其特征在于，所述步驟（1）中：a、亨廷頓蛋白基因的獲得：設計含有EcoR??和Pst??限制酶切位點的上下游引物P1和P2，從質粒pcDNA3.1/mys-His上采用PCR的方法擴增亨廷頓蛋白基因片段，將所擴增的htt基因片段和克隆載體pMD18-T載體鏈接，得到重組質粒，轉入大腸桿菌JM109中，經過氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆子，提取質粒并進行酶切鑒定和測序分析驗證，所得重組質粒命名為pMD18T-htt；b、重組表達質粒pTWIN1-htt的構建：將原核表達載體pTWIN1和重組質粒pMD18T-htt分別用限制性內切酶EcoR??和Pst??雙酶切，純化處理后將線性pTWIN1質粒片段和htt基因片段進行連接，轉化大腸桿菌JM109中，經過氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆子，提取質粒并進行酶切鑒定和測序分析驗證，所得重組質粒命名為pTWIN1-htt；c、表達亨廷頓蛋白的重組大腸桿菌菌株的構建：采用電轉化法將重組質粒pTWIN1-htt轉化入大腸桿菌DH5α感受態細胞中，利用氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆子，得到重組菌，命名為：DH5α-htt；d、重組蛋白的表達：將重組菌DH5α-htt接種至LB液體培養基，置37℃搖床過夜培養，吸取過夜培養菌體以5%接種量接種LB液體培養基，37℃搖床培養至OD600=0.5~0.7，然后置20℃搖床培養加入1mmol/L的IPTG誘導表達目的蛋白4~6h，離心收集菌體，在40mmol/L的TRIS-Acetate、5mmol/L?pH=8.3的溶液中進行超聲破碎，通過離心（23000×g，30min,?40℃）將細胞碎片和上清液分離。

3.根據權利要求1所述的亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法，其特征在于，所述的步驟（3）中合成Htt（Cys-K92-K158）多肽的過程分為三個片段合成：a、首先合成Cys-S138-K158片段；b、再合成Cys-E110-L136片段；?c、最后合成Cys-K92-I108片段；d、每個片段通過自然化學連接NCL或EPL方法連接得到Htt（Cys-K92-K158）多肽。

4.根據權利要求1所述的亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法，其特征在于，所述步驟（3）中棕櫚化修飾位于亨廷頓外顯子2或外顯子3區域，即C105位點、C109位點、C137位點、C152位點中的至少一個位點。

5.根據權利要求3所述的亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法，其特征在于，合成Cys-K92-I108片段所用的固相載體是wang－樹脂。

6.根據權利要求1所述的亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法，其特征在于，合成Cys-E110-L136片段和Cys-S138-K158片段所用的固相載體是N-酰基-苯并咪唑酮樹脂。