[發(fā)明專利]亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201310555189.6 | 申請日： | 2013-11-11 |
| 公開（公告）號： | CN103601796A | 公開（公告）日： | 2014-02-26 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 王喆明 | 申請（專利權(quán)）人： | 杭州璞題生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C07K14/47 | 分類號： | C07K14/47;C07K1/107;C12N15/70 |
| 代理公司： | 杭州華知專利事務(wù)所 33235 | 代理人： | 寧岡 |
| 地址： | 311121 浙江省杭州市余杭*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 亨廷頓 蛋白 棕櫚 修飾 方法 | ||
1.一種亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法，其特征在于，包括以下步驟：（1）、獲取重組蛋白Htt（1-90）：a、亨廷頓蛋白基因的獲得；b、重組表達(dá)質(zhì)粒pTWIN1-htt的構(gòu)建；c、表達(dá)亨廷頓蛋白的重組大腸桿菌菌株DH5α-htt的構(gòu)建；d、重組蛋白的表達(dá)；（2）、重組蛋白Htt（1-90）的純化；（3）、SPPS方法獲得棕櫚化修飾的Htt（Cys-K92-K158）多肽；（4）Htt（Cys-K92-K158）多肽的純化；（5）Htt（Cys-K92-K158）多肽與重組蛋白Htt（1-90）經(jīng)過偶聯(lián)獲得經(jīng)棕櫚化修飾目的蛋白Htt（1-158）；（6）經(jīng)棕櫚化修飾目的蛋白Htt（1-158）的純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法，其特征在于，所述步驟（1）中：a、亨廷頓蛋白基因的獲得：設(shè)計含有EcoR??和Pst??限制酶切位點(diǎn)的上下游引物P1和P2，從質(zhì)粒pcDNA3.1/mys-His上采用PCR的方法擴(kuò)增亨廷頓蛋白基因片段，將所擴(kuò)增的htt基因片段和克隆載體pMD18-T載體鏈接，得到重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中，經(jīng)過氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆子，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定和測序分析驗證，所得重組質(zhì)粒命名為pMD18T-htt；b、重組表達(dá)質(zhì)粒pTWIN1-htt的構(gòu)建：將原核表達(dá)載體pTWIN1和重組質(zhì)粒pMD18T-htt分別用限制性內(nèi)切酶EcoR??和Pst??雙酶切，純化處理后將線性pTWIN1質(zhì)粒片段和htt基因片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109中，經(jīng)過氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆子，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定和測序分析驗證，所得重組質(zhì)粒命名為pTWIN1-htt；c、表達(dá)亨廷頓蛋白的重組大腸桿菌菌株的構(gòu)建：采用電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pTWIN1-htt轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，利用氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆子，得到重組菌，命名為：DH5α-htt；d、重組蛋白的表達(dá)：將重組菌DH5α-htt接種至LB液體培養(yǎng)基，置37℃搖床過夜培養(yǎng)，吸取過夜培養(yǎng)菌體以5%接種量接種LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)至OD600=0.5~0.7，然后置20℃搖床培養(yǎng)加入1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白4~6h，離心收集菌體，在40mmol/L的TRIS-Acetate、5mmol/L?pH=8.3的溶液中進(jìn)行超聲破碎，通過離心（23000×g，30min,?40℃）將細(xì)胞碎片和上清液分離。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法，其特征在于，所述的步驟（3）中合成Htt（Cys-K92-K158）多肽的過程分為三個片段合成：a、首先合成Cys-S138-K158片段；b、再合成Cys-E110-L136片段；?c、最后合成Cys-K92-I108片段；d、每個片段通過自然化學(xué)連接NCL或EPL方法連接得到Htt（Cys-K92-K158）多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法，其特征在于，所述步驟（3）中棕櫚化修飾位于亨廷頓外顯子2或外顯子3區(qū)域，即C105位點(diǎn)、C109位點(diǎn)、C137位點(diǎn)、C152位點(diǎn)中的至少一個位點(diǎn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法，其特征在于，合成Cys-K92-I108片段所用的固相載體是wang－樹脂。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法，其特征在于，合成Cys-E110-L136片段和Cys-S138-K158片段所用的固相載體是N-酰基-苯并咪唑酮樹脂。
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