[發(fā)明專利]用于檢測(cè)人肝癌細(xì)胞標(biāo)志物的引物和探針及其檢測(cè)試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310551809.9
• 申請(qǐng)日: 2013-11-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103540679A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-01-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 方向東;蔡侃;李澤夏;程華;杜夏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及用于特異性檢測(cè)人肝癌細(xì)胞標(biāo)志物的引物和探針及其檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)

原發(fā)性肝癌(HCC)是世界最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其所致死亡率在各類腫瘤中排名第三。由于肝癌的早期癥狀不明顯，在發(fā)現(xiàn)時(shí)病人往往處于中晚期，加之肝癌的治愈率不高，預(yù)后評(píng)估效果不理想，因此早期發(fā)現(xiàn)并確定新的肝癌診斷靶點(diǎn)具有重要的臨床價(jià)值。甲胎蛋白是原發(fā)性肝癌的血清學(xué)指標(biāo)物，然而，臨床發(fā)現(xiàn)肝癌患者中甲胎蛋白（AFP）假陽(yáng)性和假陰性率偏高，憑借單一的甲胎蛋白血清學(xué)檢測(cè)早期肝癌的漏診率在50%以上。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican3，GPC3)是一類分布在細(xì)胞膜表面的蛋白聚糖，它是由glypican3基因編碼，屬Glypican家族成員。GPC3基因組結(jié)構(gòu)全長(zhǎng)大于900kb,是人類基因組中最大的基因之一。其5'端朝向端粒區(qū),3'端朝向中心粒區(qū),由8個(gè)外顯子、7個(gè)內(nèi)含子組成。編碼的GPC3蛋白前體為580個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白,分子量大小約為66kD。GPC3在HCC組織中的表達(dá)明顯增加；而且在HCC患者的血清中也可檢測(cè)到GPC3。近年來(lái)的研究表明，肝癌細(xì)胞GPC3mRNA表達(dá)與血清AFP水平、肝癌中AFP?mRNA水平、腫瘤分級(jí)及侵襲程度密切相關(guān)；而且在肝癌發(fā)展的早期階段肝癌細(xì)胞GPC3mRNA的表達(dá)率顯著高于血清中AFP和肝癌組織中AFP?mRNA的表達(dá)率,因此GPC3被認(rèn)為可作為肝細(xì)胞癌早期的敏感標(biāo)記物。

然而采用傳統(tǒng)的肝癌血清標(biāo)志物檢測(cè)方法，包括ELISA檢測(cè)技術(shù)，由于檢測(cè)的敏感性受限，而且對(duì)新標(biāo)志物未建立成熟的定量標(biāo)準(zhǔn)，因而上述傳統(tǒng)檢測(cè)方法具有很大的局限性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供用于特異性檢測(cè)人肝癌細(xì)胞標(biāo)志物的引物和探針及其檢測(cè)試劑盒。

本發(fā)明的另一目的是提供人早期肝癌細(xì)胞標(biāo)志物的多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種用于檢測(cè)人肝癌細(xì)胞標(biāo)志物的引物和探針，包括用于檢測(cè)磷脂酰肌醇蛋白聚糖cDNA的引物和探針以及用于檢測(cè)甲胎蛋白cDNA的引物和探針：

其中，用于檢測(cè)磷脂酰肌醇蛋白聚糖cDNA的引物和探針為：

上游引物GPC3F：5’-CTGTCCCTTGAAGAACTTGTGA-3’（Seq?ID?No.1）

下游引物GPC3R：5’-TTGAGAATGGGCACATAACTTG-3’（Seq?ID?No.2）

探針GPC3Probe：5’-FAM-ACAGAATCTATGACATGGAGAACGT-TAMRA-3’（Seq?ID?No.3）；

用于檢測(cè)甲胎蛋白cDNA的引物和探針為：

上游引物AFP?F：5’-GACAGCCTCAAGTTGTTCCTC-3’（Seq?ID?No.4）

下游引物AFP?R：5’-GGCTGACATTATTATCGGACAC-3’（Seq?ID?No.5）

探針AFP?Probe：5’-HEX-TATCAGACATGAAATGACTCCAGTAA-TAMRA-3’（Seq?ID?No.6）。

本發(fā)明還提供含有上述引物和探針的用于多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)人肝癌細(xì)胞標(biāo)志物的試劑盒。

優(yōu)選地，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq?DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反應(yīng)緩沖液、二甲基亞砜等中的至少一種。

本發(fā)明還提供人早期肝癌細(xì)胞標(biāo)志物的多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，通過(guò)多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)從mRNA水平上檢測(cè)人肝癌細(xì)胞中表達(dá)的甲胎蛋白信使RNA(AFP?mRNA)和磷脂酰肌醇蛋白聚糖信使RNA(GPC3mRNA)。

具體地，其是利用上述引物和探針，或上述試劑盒對(duì)人早期肝癌細(xì)胞標(biāo)志物磷脂酰肌醇蛋白和甲胎蛋白的cDNA進(jìn)行多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。包括以下步驟：

1）提取樣品組織（例如人體肝硬化穿刺組織、外周血）中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA；

2）以步驟1）中的cDNA為模板，利用上述引物（Seq?ID?No.1/2和Seq?ID?No.3/4）和探針（TaqMan探針，即Seq?ID?No.3和Seq?ID?No.6），進(jìn)行多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)；

3）利用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的cDNA作為反應(yīng)內(nèi)參；

4）繪制擴(kuò)增曲線，進(jìn)行結(jié)果判定。