[發(fā)明專利]用于檢測人肝癌細(xì)胞標(biāo)志物的引物和探針及其檢測試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310551809.9
• 申請日: 2013-11-07
• 公開（公告）號: CN103540679A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 方向東;蔡侃;李澤夏;程華;杜夏
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院北京基因組研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

1.用于檢測人肝癌細(xì)胞標(biāo)志物的引物和探針，其特征在于，包括用于檢測磷脂酰肌醇蛋白聚糖cDNA的引物和探針以及用于檢測甲胎蛋白cDNA的引物和探針：

用于檢測磷脂酰肌醇蛋白聚糖cDNA的引物和探針為：

上游引物GPC3F：5’-CTGTCCCTTGAAGAACTTGTGA-3’

下游引物GPC3R：5’-TTGAGAATGGGCACATAACTTG-3’

探針GPC3Probe：5’-FAM-ACAGAATCTATGACATGGAGAACGT-TAMRA-3’；

用于檢測甲胎蛋白cDNA的引物和探針為：

上游引物AFP?F：5’-GACAGCCTCAAGTTGTTCCTC-3’

下游引物AFP?R：5’-GGCTGACATTATTATCGGACAC-3’

探針AFP?Probe：5’-HEX-TATCAGACATGAAATGACTCCAGTAA-TAMRA-3’。

2.含有權(quán)利要求1所述引物和探針的用于多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測人肝癌細(xì)胞標(biāo)志物的試劑盒。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq?DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反應(yīng)緩沖液、二甲基亞砜中的至少一種。

4.人早期肝癌細(xì)胞標(biāo)志物的多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，其是利用權(quán)利要求1所述引物和探針，或權(quán)利要求2或3所述試劑盒對人早期肝癌細(xì)胞標(biāo)志物磷脂酰肌醇蛋白和甲胎蛋白的cDNA進(jìn)行多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）提取樣品組織中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA；

2）以步驟1）中的cDNA為模板，利用權(quán)利要求1所述引物和探針，進(jìn)行多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)；

3）利用甘油醛-3-磷酸脫氫酶的cDNA作為反應(yīng)內(nèi)參；

4）繪制擴(kuò)增曲線，進(jìn)行結(jié)果判定。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于，步驟4）中進(jìn)行結(jié)果判定的標(biāo)準(zhǔn)為：以檢測后的特異性S擴(kuò)增曲線和閾值，即Ct值作為結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，若無S曲線產(chǎn)生或Ct值≥40判定檢測結(jié)果為陰性，30＜Ct值<40判定檢測的樣品組織為正常，Ct值<30判定檢測結(jié)果為陽性。

7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的檢測方法，其特征在于，多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為：1×Taq酶緩沖液、Taq?DNA聚合酶2-3U、dNTPS0.5mM、Mg²⁺1.25-1.5mM、2%二甲基亞砜、引物各0.25-0.5μmol、探針各0.2-0.4μmol和模板1-5μl。

8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的檢測方法，其特征在于，多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性20sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，共5個(gè)循環(huán)；95℃變性20sec，50℃退火30sec，72℃延伸30sec，共40個(gè)循環(huán)。