[發明專利]一種基于液相分子雜交原理的高通量低成本SNP分型方法

有效

• 申請號: 201310549040.7
• 申請日: 2013-11-07
• 公開（公告）號: CN103555846A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 包振民;王師;焦文倩;竇錦壯;于茜;荀小罡;張玲玲;胡曉麗;陸維
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 青島聯智專利商標事務所有限公司 37101
• 代理人: 王曉曉

技術領域

本發明屬于分子生物學DNA遺傳標記技術領域，具體涉及一種基于液相分子雜交原理的高通量低成本SNP分型方法。

背景技術

單核苷酸多態性(Single?Nucleotide?Polymorphism,SNP)主要指在基因組水平上，由于單個核苷酸變異引起的DNA序列多態性。SNP具有分布廣泛、數量巨大，信息豐富，易于檢測等優點，已成為繼RFLP和SSR之后的第三代遺傳標記。目前SNP被廣泛用于遺傳圖譜的構建、群體遺傳學和親緣關系、關聯分析和基因功能分析等領域。

目前對于已知SNP位點的分型，根據不同研究需要和實驗條件，已建立了眾多檢測方法，主要的分析原理包括限制性內切酶酶切技術、等位基因特異性寡核苷酸（allele?specific?oligonucleotid,ASO）雜交、等位基因特異性引物延伸（allele?specific?primer?extension,ASPE）、單堿基延伸(single?base?extension,SBE)、寡核苷酸連接反應(oligonucleotid?ligation?assay,OLA)等。主要的信號檢測方法有基于凝膠電泳的檢測、基于微陣列技術的檢測、飛行質譜檢測和直接測序法等。其中以基于微陣列技術的分型方法通量最高,目前已有多種商業化的SNP分型技術。例如ABI公司利用OLA與微陣列技術結合建立了SNPlex?Genotyping?System；Affymetrix公司利用ASO與高密度DNA微陣列技術相結合也開發了SNP分型平臺；Illumina公司開發的GoldenGate?Genotyping?Assay,一次實驗可對96個樣本的1536個SNP位點分型。而隨著全基因組擴增技術的發展和超高密度磁珠微陣列的出現，1次對幾萬甚至幾十萬個SNP分型也成為可能。

然而目前這些基于微陣列技術的高通量SNP分型方法在基因組信息豐富、芯片平臺相對完善的人類和模式生物中應用較多。對于遺傳信息相對匱乏的非模式生物，尤其是那些基因組較大，雜合性較高的物種，其芯片造價昂貴；且一次定制的芯片僅對固定位點分型，位點選擇靈活性不高；一張芯片只用于一個個體使用，對樣本量較大的群體分析和關聯分析仍存在較大挑戰。因而亟需一種靈活方便、成本低廉、高通量的SNP分型技術解決現有技術的局限性。

隨著新一代測序技術通量不斷提高和成本持續下降，借助測序技術實現生物高通量SNP分型成為可能。借助已知基因組信息的重測序、以簡化基因組測序為基礎的RAD、2bRAD等高通量技術目前已成功用于全基因組SNP的開發。然而對于已知SNP位點的定點分型，現有測序分型的方法并沒有充分發揮高通量測序的優勢，仍屬于中低通量分型方法，無法實現同時對多位點、多樣本的高通量分型。

發明內容

本發明的目的在于開發一種新型生物高通量、高準確性、高靈活性、低成本、方便快捷的SNP分型方法，以彌補現有技術的上述不足。

為了實現上述目的，本發明采用下述技術方案予以實現：

一種基于液相分子雜交原理的高通量低成本SNP分型方法，所述方法包括以下步驟：

1）提取生物基因組DNA，并對其進行生物素標記；

2）根據生物已知SNP位點的側翼序列，設計引物LSP1和LSP2，分別混合后得到引物LSP1混合物和引物LSP2混合物，并將引物LSP2混合物進行5’磷酸化；

3）將所述引物LSP1混合物和引物LSP2混合物與生物基因組DNA雜交，并進行磁珠吸附獲得雜交吸附產物；

4）所述雜交吸附產物進行延伸連接反應獲得目的DNA片段；

5）第一輪PCR擴增及目的DNA片段擴增，PCR擴增引物為測序平臺通用配對引物5SLD和3SLD，或Slx-1ST-MpPrimer-1和Slx-1ST-MpPrimer-2；

6）對目的DNA片段進行Barcode特異性引物二輪PCR擴增，PCR擴增引物為Multi-P1和Barcode-P2，或Slx-2ND-MpPrimer和Slx-index-Barcode；

7）高通量測序；

8）測序數據分析得到SNP位點分型信息。

對技術方案的進一步改進：所述步驟(2)中引物LSP1包括3’端的位點特異性引物SP1和5’端的5SLD兩部分，3’端的引物SP1為與SNP位點鄰近的22個堿基互補的序列，5’端為通用引物5SLD5'-CTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3'；