[發明專利]一種基于液相分子雜交原理的高通量低成本SNP分型方法

有效

• 申請號: 201310549040.7
• 申請日: 2013-11-07
• 公開（公告）號: CN103555846A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 包振民;王師;焦文倩;竇錦壯;于茜;荀小罡;張玲玲;胡曉麗;陸維
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 青島聯智專利商標事務所有限公司 37101
• 代理人: 王曉曉

1.一種基于液相分子雜交原理的高通量低成本SNP分型方法，其特征在于所述方法包括以下步驟：

1）提取生物基因組DNA，并對其進行生物素標記；

2）根據生物已知SNP位點的側翼序列，設計引物LSP1和LSP2，分別混合后得到引物LSP1混合物和引物LSP2混合物，并將引物LSP2混合物進行5’磷酸化；

3）將所述引物LSP1混合物和引物LSP2混合物與生物基因組DNA雜交，并進行磁珠吸附獲得雜交吸附產物；

4）所述雜交吸附產物進行延伸連接反應獲得目的DNA片段；

5）?第一輪PCR擴增及目的DNA片段擴增，PCR擴增引物為測序平臺通用配對引物5SLD和3SLD，或Slx-1ST-MpPrimer-1和Slx-1ST-MpPrimer-2；

6）對目的DNA片段進行Barcode特異性引物二輪PCR擴增，PCR擴增引物為Multi-P1和Barcode-P2，或Slx-2ND-MpPrimer和Slx-index-Barcode；

7）高通量測序；

8）測序數據分析得到SNP位點分型信息。

2.根據權利要求1所述的基于液相分子雜交原理的高通量低成本SNP分型方法，其特征在于所述步驟(2)中引物LSP1包括3’端的位點特異性引物SP1和5’端的5SLD兩部分，?3’端的引物SP1為與SNP位點鄰近的22個堿基互補的序列，5’端為通用引物5SLD?5'-CTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3'；

引物LSP2包括5’端的位點特異性引物SP2和3’端的3SLD-RC兩部分，?5’端的引物SP2為與SNP位點另一側第4個堿基后的22個堿基互補的序列，3’端為通用引物3SLD?的反向互補序列5'-?TTCGCCTTGGCCGTACAGCAG-3'。

3.根據權利要求2所述的基于液相分子雜交原理的高通量低成本SNP分型方法，其特征在于所述步驟(2)?中位點特異性引物SP1和SP2設計原則如下：?1)、SP1和SP2所在的位置不能含有其他SNP位點或插入缺失；2)、SP1和SP2所在的位置序列不能出現5個以上連續的相同堿基；3)、SP1和SP2的Tm值在55-65℃之間；?4)、SP1和SP2的長度定為20-24nt。

4.根據權利要求1所述的基于液相分子雜交原理的高通量低成本SNP分型方法，其特征在于所述步驟(3)中所述雜交及磁珠吸附方法如下：位點特異性引物與基因組DNA雜交反應總體積為50uL，包含1×雜交液，250nM?LSP1?引物混合物，250nM?5’磷酸化的LSP2?引物混合物，200ng生物素標記的基因組DNA，經平衡后懸浮于10ul?Wash/Binding?Buffer的磁珠；

雜交反應條件為：70℃?12分鐘，以后每個循環減2℃；69℃?12分鐘，以后每個循環減2℃，進行20個循環后，保持30℃，整個雜交反應進行至少16小時。

5.根據權利要求1所述的基于液相分子雜交原理的高通量低成本SNP分型方法，其特征在于所述步驟(4)?中延伸連接反應的體系為50uL，包含經洗滌得到的雜交吸附產物，1U?DNA?聚合酶，80U?DNA?連接酶，1×HF?Buffer，1mM?NAD，?5mM?dNTPs；45℃反應15分鐘。

6.根據權利要求1所述的基于液相分子雜交原理的高通量低成本SNP分型方法，其特征在于所述步驟(5)中所述PCR擴增引物序列如下：

5SLD：5'CTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT3'

3SLD:?5'CTGCTGTACGGCCAAGGCGAA3'

Slx-1ST-MpPrimer-1:?5'?ACACTCTTTCCCTACACGACGCT?3'；

Slx-1ST-MpPrimer-2:?5'?GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT?3'。