[發(fā)明專利]小鼠整合素蛋白LFA-1分子插入結(jié)構(gòu)域muαL Id的抗體J7的篩選方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310547824.6
• 申請日: 2013-11-07
• 公開（公告）號: CN103626872A
• 公開（公告）日: 2014-03-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡學(xué)博;胡延如
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C40B30/04;C12N15/70;C12N15/85
• 代理公司: 武漢開元知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 42104
• 代理人: 徐紹新

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種構(gòu)建酵母表面雙雜交系統(tǒng)篩選小鼠整合素蛋白LFA-1分子插入結(jié)構(gòu)域Mu?αL?Id的抗體J7的方法。?

背景技術(shù)

酵母表面展示是將外源蛋白表達(dá)于酵母體內(nèi)并通過酵母表達(dá)凝集素的特殊結(jié)構(gòu)將其攜帶至細(xì)胞表面的一種技術(shù)（Boder?and?Wittrup，1997）。自然條件下酵母有a型和α型兩種交配類型，這兩類酵母交配依靠其細(xì)胞表面的凝集素，其中a型含有凝集素Aga1和Aga2兩個(gè)蛋白亞基。已知Aga1共價(jià)連接于酵母表面的β-葡聚糖，而Aga2又與Aga1之間形成兩對二硫鍵（Cappellaro?et?al.,1991；Chen?et?al.,1995）。注意到這個(gè)現(xiàn)象，Boder和Wittup等將Aga1蛋白整合到酵母基因組，并用一個(gè)質(zhì)粒載體以Gall啟動子表達(dá)Aga2和外源基因的融合蛋白。因此在半乳糖誘導(dǎo)下，外源基因便以融合蛋白的形式隨Aga2轉(zhuǎn)移到酵母表面。由于融合蛋白被共價(jià)地展示于細(xì)胞表面，可以方便地用外源蛋白的受體或抗體，或置于外源蛋白前或后的寡肽的通用抗體來檢測蛋白的表達(dá)，借助常用的流式細(xì)胞儀，可快速定量檢測外源蛋白與受體間的親和力。?

酵母表面雙雜交系統(tǒng)，是通過分泌途徑來分析蛋白互作的一個(gè)平臺，這種系統(tǒng)是在酵母表面展示系統(tǒng)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，優(yōu)點(diǎn)在于無需蛋白表達(dá)純化，在酵母體內(nèi)同時(shí)表達(dá)這兩個(gè)蛋白并最終展示于酵母表面。在YSD基礎(chǔ)上酵母表面展示一個(gè)外源蛋白X，另一個(gè)蛋白Y則以分泌的形式表達(dá)，如果X能結(jié)合Y，那么Y則可以與X一起附于酵母表面，利用Y或與Y融合的寡肽的抗體來檢測他們的親和性，并且X和Y之間的親和性可以通過流式細(xì)胞儀定量（Hu,.et?al.,2009)。這種技術(shù)的創(chuàng)新性在于：①首創(chuàng)Gall和Gall0啟動子的聯(lián)用。②建立利用酵母蛋白分泌途徑的蛋白-蛋白相互作用體系。③本系統(tǒng)無需蛋白純化即可進(jìn)行蛋白的定向進(jìn)化以及文庫受體篩選。?

淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(lymphocyte?function?associated?antigen-1,LFA-1)屬于整合素家族,整合素是一類重要的細(xì)胞黏附分子,是由α和β兩個(gè)亞基通過非共價(jià)鍵組成的異源二聚體,整合素可以通過其胞內(nèi)區(qū)與胞內(nèi)的細(xì)胞骨架蛋白和信號分子結(jié)合,通過由內(nèi)到外(inside-out)?和由外到內(nèi)(outside-in)雙向傳遞跨膜信號(Abrams.et?al.，2010)。這些過程伴隨著整合素對其配體親和力的改變。整合素的這些特性對于生物體的免疫反應(yīng)、細(xì)胞遷移、免疫細(xì)胞的組織定位、凝血、組織愈傷、組織和器官的發(fā)育,甚至神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能等都至關(guān)重要。LFA-1作為整合素的一員具有同樣的特性(Bon?G.et?al.2007)，LFA-1通過與其配體ICAM-1結(jié)合,促進(jìn)炎癥細(xì)胞之間的黏附及炎癥細(xì)胞向局部的趨化反應(yīng),從而促進(jìn)疾病的發(fā)生發(fā)展。抗LFA-1的抗體對淋巴細(xì)胞從外周血向淋巴結(jié)的遷移可以有明顯的干擾作用。篩選抗LFA-1抗體對于檢測LFA-1的水平和阻斷LFA-1與其配套ICAM-1的結(jié)合從而抑制相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要作用。MuαL?Id(小鼠整合素蛋白LFA-1份子的插入結(jié)構(gòu)域)就屬于這個(gè)家族的一員，篩選這個(gè)物質(zhì)的抗體對于一些疾病的防治和靶標(biāo)用藥具有重要作用。?

傳統(tǒng)制備抗體的方法是通過人工免疫或雜交瘤細(xì)胞得到，這種方法制備的抗體特異性差，并且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，制備可溶性抗原過程中會不同程度破壞抗原的天然構(gòu)象，通過傳統(tǒng)方法制備的抗體與抗原之間的親和力大小不能被定量測定。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種高效快速篩選MuαL?Id抗體J7的方法。?

上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：?

一種MuαL?Id抗體J7的篩選方法，包括以下步驟：?

1）將小鼠整合素蛋白LFA-1份子的插入結(jié)構(gòu)域(MuαL?Id)展示于酵母細(xì)胞EBY100表面，得到表面展示有MuαL?Id的酵母細(xì)胞，展示在酵母表面的蛋白結(jié)構(gòu)包括MuαL?Id胞外域、Myc標(biāo)簽和Aga2的N端到C端區(qū)域，然后用流式細(xì)胞儀檢測蛋白是否表達(dá)；?

2）在酵母細(xì)胞EYB100表面表達(dá)不相關(guān)蛋白Zif268，然后與噬菌體抗體庫共同孵育，以除去非特異性噬菌體，得到表達(dá)特異性抗體的噬菌體；?

3）將步驟1）得到的表面展示有MuαL?Id抗原的酵母細(xì)胞與除去非特異性噬菌體后的噬菌體抗體庫共同孵育，使展示于所述酵母細(xì)胞表面的抗原和展示于噬菌體表面的抗體發(fā)生特異性的結(jié)合，得到所述酵母細(xì)胞與所述噬菌體的特異性結(jié)合物，將所述結(jié)合物從孵育體系中分離出來；?