[發(fā)明專利]小鼠整合素蛋白LFA-1分子插入結構域muαL Id的抗體J7的篩選方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310547824.6
• 申請日: 2013-11-07
• 公開（公告）號: CN103626872A
• 公開（公告）日: 2014-03-12
• 發(fā)明（設計）人: 胡學博;胡延如
• 申請（專利權）人: 華中農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C40B30/04;C12N15/70;C12N15/85
• 代理公司: 武漢開元知識產(chǎn)權代理有限公司 42104
• 代理人: 徐紹新

1.小鼠整合素蛋白LFA-1分子插入結α構域MuαL?Id的抗體J7的篩選方法，其特征在于包括以下步驟：

1）將MuαL?Id展示于酵母細胞EBY100表面，得到表面展示有MuαL?Id抗原的酵母細胞，展示在酵母表面的蛋白結構包括MuαL?Id胞外域、Myc標簽和α半乳糖苷酶Aga2基因的N端到C端區(qū)域，然后用流式細胞儀檢測蛋白是否表達；

2）在酵母細胞EYB100表面表達不相關蛋白，然后與噬菌體抗體庫共同孵育，以除去非特異性噬菌體，得到表達特異性抗體的噬菌體；

3）將步驟1）得到的表面展示有MuαL?Id抗原的酵母細胞與除去非特異性噬菌體后的噬菌體抗體庫共同孵育，使展示于所述酵母細胞表面的抗原和展示于噬菌體表面的抗體發(fā)生特異性的相互配對，得到所述酵母細胞與所述噬菌體的特異性結合物，將所述結合物從孵育體系中分離出來；

4）從步驟3）得到的結合物中分離得到與展示于酵母細胞表面的MuαL?Id抗原特異性結合的噬菌體，并轉(zhuǎn)入到宿主細菌Escherichia?coli，提取質(zhì)粒，測序；將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到細菌HB2151并表達、純化單鏈抗體scFv片段，用純化蛋白進一步檢測其與表達有抗原的酵母結合力；

5)將單鏈抗體即scFv片段轉(zhuǎn)化為抗體全基因片段，即scFv-Fc。

2.根據(jù)權利要求1所述的小鼠整合素蛋白LFA-1分子插入結構域MuαL?Id的抗體J7的篩選方法，其特征在于：步驟1）中所述的將MuαL?Id展示于酵母細胞EBY100表面是按以下方法實現(xiàn)的：將含有MuαL?Id編碼基因的重組表達載體轉(zhuǎn)入所述酵母細胞EBY100中，得到重組酵母細胞，培養(yǎng)該重組酵母細胞并誘導所述重組載體的表達。

3.根據(jù)權利要求1所述的小鼠整合素蛋白LFA-1分子插入結構域MuαL?Id的抗體J7的篩選方法，其特征在于：步驟2）中所述的在酵母細胞表面表達不相關蛋白，然后與噬菌體抗體庫共同孵育，以除去非特異性噬菌體是按以下步驟實現(xiàn)的：

1）2x10^13個噬菌體克隆先在含有2%的脫脂奶粉的PBS溶液中室溫培養(yǎng)30min；

2）然后向1）中加入2x10^7個表達不相關蛋白的酵母細胞EYB100，兩種細胞的混合液在攪拌下室溫培養(yǎng)1h；

3）未結合在酵母細胞表面的噬菌體克隆通過離心作用留在上清液中，離心后取上清液；

4）將上清液加入酵母細胞EYB100，離心后去上清，然后用PBS和0.05%吐溫20將菌塊洗5次；

5）用胰蛋白酶處理將噬菌體從酵母細胞表面洗脫下來，然后將洗下的噬菌體導入大腸桿菌TG1中進行克隆，為下一輪篩選提供更多的噬菌體克??；

6）經(jīng)過3輪復篩，即得到表達特異性抗體的噬菌體。

4.根據(jù)權利要求1所述的小鼠整合素蛋白LFA-1分子插入結構域MuαL?Id的抗體J7的篩選方法，其特征在于：步驟4）中所述的純化單鏈抗體scFv片段的步驟為：首先，將不同篩選批次的噬菌體分別與表達有特異抗原的酵母結合，流式細胞儀檢測顯示第三輪篩選的文庫比前兩輪的親和力明顯比前兩輪提高很多；然后，將攜帶有第三輪噬菌體質(zhì)粒的細菌涂布于培養(yǎng)皿，挑選單個克隆進行液體培養(yǎng)，并進一步在96孔板中生產(chǎn)小量的噬菌體，取每個克隆的噬菌體和表達特異抗原的酵母結合，用流式細胞儀檢測結合水平；最后，選取流式細胞儀檢測結果中表達水平高的細菌，并提取其中的質(zhì)粒，進行測序。

5.根據(jù)權利要求1所述的小鼠整合素蛋白LFA-1分子插入結構域MuαL?Id的抗體J7的篩選方法，其特征在于：步驟5）中所述的scFv片段轉(zhuǎn)化為scFv-Fc的方法如下：將scFv片段和IgG1蛋白的Fc片段克隆進載體pcDNA3.1，得到重組載體，將重組載體導入293T細胞，scFv-Fc連接蛋白通過293T細胞表達，然后上清液用A蛋白珠純化，即得到篩選出的抗體完整結構。