[發明專利]一種幾丁質脫乙酰基酶及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 201310547193.8
• 申請日: 2013-11-06
• 公開（公告）號: CN104630193A
• 公開（公告）日: 2015-05-20
• 發明（設計）人: 張繼泉;桂天書;孫玉英;王婧;相建海
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: C12N9/80
• 分類號: C12N9/80;C12N15/55;C12N15/70;C12P19/26;C12R1/085
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體的說一種幾丁質脫乙?；讣捌錁嫿ǚ椒ê蛻?。

背景技術

幾丁質（chitin）是由N-乙酰氨基葡萄糖以β-1,4糖苷鍵連接而成的多聚體，是天然多糖中十分重要的一類，其數量僅次于世界上資源最豐富的纖維素，但其利用價值比纖維素更高，是自然界中數量第二多的的含氮類有機化合物，被歐美學術界稱為世界第六生命要素。很多類似于蝦蟹等節肢動物的外殼里都存在幾丁質；像昆蟲、動物體表及消化道里也含有豐富的幾丁質。

據估計，自然界中的幾丁質的生物合成量超過1000億噸，而人類每年所需幾丁質的量也高達3.7×10⁴噸，主要是海洋動物產品加工的廢棄物。另外，海洋中產生的大量廢棄物中，幾丁質將近一億噸，而且海洋生物圈中產生的幾丁質占全球幾丁質總量的絕大部分，可以說是一種取之不盡的生物寶庫。

而殼聚糖（脫乙酰甲殼素，chitosan）是幾丁質的一類最重要的衍生物，也是自然存在的唯一一種堿性低聚多糖，可以應用于食品、化妝品、紡織、醫療、印染、保健、廢水處理等許多領域，其利用價值很高，是市場推廣和產品研發的有力組成部分。

目前工業上生產殼聚糖普便采用強堿熱化學法，該方法生產殼聚糖存在較多的缺陷和不足，主要包括以下幾方面：生產過程耗能大、消耗大量強堿，嚴重污染環境，不能獲得質量均一、具有特定脫乙酰度的殼聚糖等。幾丁質脫乙酰酶能夠催化幾丁質生成殼聚糖，具有工藝條件溫和、環境友好、產品質量高等優點。采用幾丁質脫乙酰酶生產殼聚糖則可以解決強堿熱化學法制備殼寡糖的諸多缺陷和不足，生產出質量均一、性能穩定的殼聚糖，滿足生物醫學等領域對殼聚糖的高質量要求。

發明內容

本發明目的在于為解決目前酶法制備殼聚糖工藝中的幾丁質脫乙酰酶不足的問題，提供一種幾丁質脫乙酰基酶及其構建方法和應用。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

一種幾丁質脫乙?；?，蠟狀芽孢桿菌（Bacillus?cereus?ATCC10987）幾丁質脫乙?；福╟hitin?deacetylase，CDA）核苷酸序列為SEQ?ID?NO.2所示，或者

在SEQ?ID?NO.2中限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或者幾個氨基酸且仍具有幾丁質脫乙酰基酶活性的由SEQ?ID?NO.2衍生出來的蛋白質。

所述幾丁質脫乙?；妇幋a的基因核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1所示。

幾丁質脫乙?；傅臉嫿ǚ椒ǎ?/p>

1）構建幾丁質脫乙?；钢亟M表達載體質粒pCT7-CHISP6H-BcCDA；

2）將步驟1)所得重組表達載體質粒導入大腸桿菌宿主細胞（BL21(DE3)），進行誘導表達，獲得表達產物；

3）以金屬螯合層析柱分離純化步驟2)所得到的重組蛋白，即SEQ?ID?NO.2中氨基酸所示的重組幾丁質脫乙?；?；或者

在SEQ?ID?NO.2中限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或者幾個氨基酸且仍具有幾丁質脫乙?；富钚缘挠蒘EQ?ID?NO.2衍生出來的蛋白質。

所述步驟3）中以金屬螯合層析柱一步法純化獲得電泳純的SEQ?ID?NO.2中氨基酸所示的重組幾丁質脫乙?；浮?/p>

幾丁質脫乙?；傅膽?，其特征在于：所述重組幾丁質脫乙?；缚捎糜谥苽錃ぞ厶?。

本發明所具有的優點：本發明獲得了一種幾丁質脫乙?；窧cCDA基因序列，并在大腸桿菌中實現其高效分泌表達以及一步法純化重組幾丁質脫乙?；窧cCDA。所得重組BcCDA的脫乙酰基活性，為酶法制備殼聚糖工藝的開發與應用提供了基礎。具體的說本發明重組幾丁質脫乙?；窧cCDA的獲得對幾丁質資源的深度開發與高值化利用具有重要的理論意義和實踐意義。

附圖說明

圖1為本發明實施例提供的BcCDA基因推導的氨基酸序列特征。

圖2為本發明實施例提供的誘導表達的重組幾丁質脫乙酰基酶酶解實驗結果，其中，A為未涂布幾丁質脫乙?；甘覝胤胖?天后的4-硝基乙酰苯胺固體平板；B為涂布幾丁質脫乙?；甘覝胤胖?天后的4-硝基乙酰苯胺固體平板；C為涂布幾丁質脫乙酰基酶室溫放置7天后的4-硝基乙酰苯胺固體平板。

圖3為本發明實施例提供的重組蛋白rBcCDA經親和層析純化色譜圖。圖中方框處標注的吸收峰即為通過分段洗脫得到的rBcCDA。

圖4為發明實施例提供的親和層析純化后的重組蛋白脫鹽結果。