[發明專利]云芝及含有云芝的制劑的檢測方法

有效

• 申請號: 201310546455.9
• 申請日: 2013-11-07
• 公開（公告）號: CN103604879B
• 公開（公告）日: 2017-01-11
• 發明（設計）人: 韋紅言;溫慶偉;周永強;覃艷霞;寧平行
• 申請（專利權）人: 培力（南寧）藥業有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙)11350
• 代理人: 羅保康

技術領域

本發明涉及一種云芝及含有云芝的制劑的檢測方法，具體涉及云芝藥材以及含有云芝、或云芝有效部位、或云芝有效部位群的制劑的質量控制和評價方法。

背景技術

云芝為多孔菌科真菌彩絨革蓋菌Coriolus?versicolor?(L.ex?Fr.)?Quel干燥子實體。東漢時期《神農本草經》已有記載以云芝治療癌癥，《本草綱目》記載云芝有安神、益壽、利關節、堅筋骨、治耳聾作用。現代研究表明，從云芝中提取的云芝多糖用于腫瘤患者的輔助治療，能顯著提高癌癥病人的生存質量，增強免疫，減少繼發感染，緩解病痛，改善癌癥患者的食欲減退作用。由于云芝多糖的獨特活性與低毒效應在臨床應用中具有極大的潛力，針對云芝多糖類成分開發的保健品、藥品日益增加，1977年，從云芝中提取純化的云芝多糖（PSK），在日本被開發成抗癌新藥Krestin；1998年，以從云芝中提取純化得到的云芝多糖肽（PSP）為主要成分的云芝糖肽膠囊正式獲得我國衛生部的正式生產批準文號，目前已上市產品有云芝糖肽、云芝菌膠囊、云芝肝泰片、云芝肝泰膠囊等。目前，國內總多糖含量測定主要采取紫外分光光度法進行，經典的顯色體系有苯酚-硫酸法（λmax=490nm）和蒽酮-硫酸法（λmax=?630nm），均選擇無水葡萄糖為對照品。也有采用滴定法測定總多糖含量的，常用有斐林氏滴定法和間接碘量滴定法。如2010版《中國藥典》中，云芝藥材中的總多糖含量測定就采用的是間接碘量法。由于云芝藥材及其制劑大多為有色樣品，應用此類方法測定樣品中的云芝總多糖時，方法的干擾因素多，結果準確度、專屬性差。在國外對多糖的質量控制多采用高效凝膠色譜法測定多糖分子量及其分布，這也是對多糖產品質控手段之一，其對純度較高的多糖產品質量控制較好，能有效的評價該產品的真偽。國內云芝類產品也有采用高效凝膠色譜法測定多糖分子量及其分布，以此來評價該類產品的質量，此方法能在一定程度上控制產品的質量，但對于主要含多糖類成分的云芝藥材及其制劑的質量控制方法較少，由于它們所含的有效多糖是一大類，很難對其多糖含量、分子量分布范圍來評價藥材及其制劑質量的真偽和優劣，該評價方式不能反映它們整體的內在質量變化，存在一定的不合理性和不科學性，且專屬性也較差。同時，云芝藥材及其制劑中多糖分子組成、空間結構不同，而以相應對照品測得的樣品多糖的分子量，并非分子量的絕對值。

發明內容

本發明的目的是提供一種準確度高、專屬性強、操作簡便的云芝及含有云芝的制劑的檢測方法，以便更好進行質量控制和評價。

本發明根據云芝藥材及其制劑多糖的單糖組成是其一級結構的主要內容，是其空間結構的基礎，首先需要將其多糖進行完全酸水解為單糖類物質之后，其中所含單糖的成分、各單糖成分含量的相互比例應該是具有物種唯一性和個體相似性的，因此，針對其開展的色譜分析，所獲的色譜圖譜具有較強的專屬性。采用液相色譜分離檢測技術，分析云芝藥材及其制劑中多糖的單糖組成，建立相應的特征圖譜，通過運用多糖中單糖組分特征圖譜的相對保留時間和相對峰面積來評價該藥材真偽，該質量控制和評價方法具有較強的專屬性和創新性。同時，在特征圖譜的基礎上，建立單糖組分定量測定，并制定各含量限度，通過對單糖質量的控制可間接控制多糖的含量，以此質量控制方法評價藥材質量的優劣，該質量控制和評價方法具有較高精確度和新穎性。

本發明的技術方案是：

取云芝藥材3～6g（加水適量，加熱回流提取，提取液離心，量取適量提取液,減壓濃縮至適量）或制劑0.5～1g（加水使溶解），加入3～6倍體積的無水乙醇，分取沉淀，沉淀加水溶解，并加入稀硫酸（濃度為10%），100-120℃加熱回流水解5-6小時，水解后溶液調pH至中性并定容，吸取上清液，置具塞試管中，加入NaOH溶液和PMP的甲醇溶液，于60～80℃衍生化反應30-60min，反應完全后調PH至中性并定容，取上清液加等體積三氯甲烷振搖提取，棄去有機溶液，重復操作3次，水溶液減壓濃縮至適量用乙腈定容，作為供試品溶液；取D-甘露糖、D-葡萄糖、半乳糖和L-巖藻糖對照品適量，加水溶解，按上述供試品溶液的衍生方法制備混合對照品溶液，分別精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液，注入高效液相色譜儀或超高效液相色譜儀，測定各單糖含量。其中超高效液相色譜檢測條件是：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流速為0.3～1.0毫升/分鐘；檢測波長245nm；以乙腈為流動相A，以磷酸緩沖鹽溶液（稱取K₂HPO₄?4.4g，加水800mL溶解，加磷酸調pH至6.5，并加水稀釋至1000mL）為流動相B，流動相梯度洗脫表：