[發明專利]一種腸出血性大腸桿菌O157:H7 ELISA抗體檢測試劑盒及其使用方法

有效

• 申請號: 201310545709.5
• 申請日: 2013-11-06
• 公開（公告）號: CN103558377A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 羅玲;邵華斌;羅青平;溫國元;艾地云;王紅琳;茍妙
• 申請（專利權）人: 湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 崔友明

技術領域

本發明涉及一種腸出血性大腸桿菌O157:H7ELISA抗體檢測試劑盒及其使用方法，屬于抗體檢測領域。?

背景技術

腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic?Escherichia?coli,EHEC)等食源性病原微生物是當今世界上不斷增多的食品安全和突發性公共衛生事件的主要誘因。在食源性病原微生物中,EHEC占有重要地位，主要包括O157:H7、O26:H11和O111,O157:H7是出血性腸炎的主要致病菌。O157:H7感染具有暴發流行趨勢、強烈的致病性與致死性以及抗生素治療可能會加劇病情等特點。1982年，O157:H7首先在美國發現，此后在世界各地散發或地方流行,已成為全球性的公共衛生和食品安全問題。?

目前,國內外已報道的檢測方法大多對抗原進行檢測，而缺乏對抗體檢測方法的研究，因而有必要建立快速、簡便、特異的抗體檢測方法。?

O157:H7LEE毒力島上的eae基因編碼的94kDa的外膜蛋白即緊密素（intimin）是EHEC重要的外膜蛋白，其介導細菌與上皮細胞的緊密黏附，是最重要的黏附因子，可產生A/E病變。O157:H7主要依靠緊密素及其受體黏附于腸上皮細胞，緊密素的特異性抗體可阻斷細菌的黏附而使其喪失致病力，具有較強的免疫原性和免疫保護性，是理想的疫苗備選抗原。Intimin蛋白為包被抗原的ELISA抗體檢測試劑盒對大腸桿菌O157:H7的流行病學調查以及疫苗效果評估有重要作用。?

發明內容

本發明的目的是提供一種腸出血性大腸桿菌O157:H7ELISA抗體檢測試劑盒，該試劑盒選擇腸出血性大腸桿菌O157:H7LEE毒力島上的eae基因的表達產物intimin包被酶標板及其應用方法，其可快速檢測血清中大腸桿菌O157:H7特異性抗體，了解雞體抗體水平或感染狀況，對于該病的流行病學調查有著重要作用。?

本發明為解決上述技術問題而采取的技術方案為：一種腸出血性大腸桿菌O157:H7ELISA抗體檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒包括：a）包被板、b）10×濃縮洗滌液、c）稀釋液、d）酶標二抗、e）底物A液、底物B液、底物緩沖液、f）陰、陽性對照血清、g）終止液，所述的包被板為包被抗原的96孔板，其包括包被純化的intimin蛋白和包被液，包被濃度為0.88μg/mL，所述的intimin蛋白是腸出血性大腸桿菌O157:H7LEE毒力島上的eae基因原核表達產物，eae基因的上游引物為5‘-GGGAATTCCATATGATTACTCATGGTTGTTAT-3’，下游引物?為5‘-CCGTCTCGAGTTCTACACAAACCGCATAG-3’。?

按上述方案，所述的包被液為0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH值為9.6，按如下配方進行配制：Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，加ddH₂O定容至1000ml。?

按上述方案，所述的10×濃縮洗滌液為含5%Tween-20的10×PBST，pH值為7.4，按如下配方進行配制：10×PBS1000ml，Tween-205ml。?

按上述方案，所述的10×PBS濃度為0.1mol/L，pH值為7.4，按如下配方進行配制：Na₂HPO₄.12H₂O58g，KH₂PO₄4g，NaCl160g，KCl4g，溶于980ml?ddH₂0中，調pH至7.4，定容至1000ml。?

按上述方案，所述的稀釋液為含1%MILK的PBST，按如下配方進行配制：取用ddH₂O10倍稀釋的濃縮洗滌液100ml，MILK1.0g，混合。?

按上述方案，所述的酶標二抗為兔抗雞lgY-HRP。?

按上述方案，所述的底物緩沖液9.5ml，底物A液32ul，底物B液0.5ml，混勻，其中所述的底物A液配制方法為H₂O₂0.75ml、三蒸水100ml，混合，4℃避光保存；所述的底物B液配制方法為TMB0.1g、無水乙醇50ml，混合，4℃避光保存；所述的底物緩沖液：檸檬酸.H₂O4.91g，Na₂HPO₄.12H₂O19.38g，加ddH₂O定容至1000ml。?