[發(fā)明專(zhuān)利]一種腸出血性大腸桿菌O157:H7 ELISA抗體檢測(cè)試劑盒及其使用方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310545709.5
• 申請(qǐng)日: 2013-11-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103558377A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-02-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 羅玲;邵華斌;羅青平;溫國(guó)元;艾地云;王紅琳;茍妙
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/569
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/569
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專(zhuān)利代理有限公司 42102
• 代理人: 崔友明

1.一種腸出血性大腸桿菌O157:H7ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，其特征在于該試劑盒包括：a）包被板、b）10×濃縮洗滌液、c）稀釋液、d）酶標(biāo)二抗、e）底物A液、底物B液、底物緩沖液、f）陰、陽(yáng)性對(duì)照血清、g）終止液，所述的包被板為包被抗原的96孔板，其包括包被純化的intimin蛋白和包被液，包被濃度為0.88μg/mL，所述的intimin蛋白是腸出血性大腸桿菌O157:H7LEE毒力島上的eae基因原核表達(dá)產(chǎn)物，eae基因的上游引物為5‘-GGGAATTCCATATGATTACTCATGGTTGTTAT-3’，下游引物為5‘-CCGTCTCGAGTTCTACACAAACCGCATAG-3’。

2.按權(quán)利要求1所述的腸出血性大腸桿菌O157:H7ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的包被液為0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH值為9.6，按如下配方進(jìn)行配制：Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，加ddH₂O定容至1000ml。

3.按權(quán)利要求1所述的腸出血性大腸桿菌O157:H7ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的10×濃縮洗滌液為含5%Tween-20的10×PBST，pH值為7.4，按如下配方進(jìn)行配制：10×PBS1000ml，Tween-205ml。

4.按權(quán)利要求1所述的腸出血性大腸桿菌O157:H7ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的10×PBS濃度為0.1mol/L，pH值為7.4，按如下配方進(jìn)行配制：Na₂HPO₄.12H₂O58g，KH₂PO₄4g，NaCl?160g，KCl?4g，溶于980ml?ddH₂0中，調(diào)pH至7.4，定容至1000ml。

5.按權(quán)利要求1所述的腸出血性大腸桿菌O157:H7ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的稀釋液為含1%MILK的PBST，按如下配方進(jìn)行配制：取用ddH₂O10倍稀釋的濃縮洗滌液100ml，MILK1.0g，混合。

6.按權(quán)利要求1所述的腸出血性大腸桿菌O157:H7ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的酶標(biāo)二抗為兔抗雞lgY-HRP。

7.按權(quán)利要求1所述的腸出血性大腸桿菌O157:H7ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的底物緩沖液9.5ml，底物A液32ul，底物B液0.5ml，混勻，其中所述的底物A液配制方法為H₂O₂0.75ml、三蒸水100ml，混合，4℃避光保存；所述的底物B液配制方法為T(mén)MB0.1g、無(wú)水乙醇50ml，混合，4℃避光保存；所述的底物緩沖液：檸檬酸.H₂O4.91g，Na₂HPO₄.12H₂O19.38g，加ddH₂O定容至1000ml。

8.按權(quán)利要求1所述的腸出血性大腸桿菌O157:H7ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的陰性對(duì)照血清為采集健康的SPF雞血，離心取上清，保存?zhèn)溆茫凰龅年?yáng)性對(duì)照血清為采集抗O157:H7的SPF雞血，離心取上清，保存?zhèn)溆谩?!-- SIPO -->

9.按權(quán)利要求1所述的腸出血性大腸桿菌O157:H7ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的終止液為2mol/L?H₂SO₄，按如下配方進(jìn)行配制：取濃H₂SO₄55.5ml，緩慢滴加到ddH₂0中，冷卻后定容至500ml。

10.腸出血性大腸桿菌O157:H7ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于包括有以下步驟：

1）取包被抗原的96孔板，其包括包被純化的intimin蛋白和包被液，包被濃度為0.88μg/mL，所述的intimin蛋白是腸出血性大腸桿菌O157:H7LEE毒力島上的eae基因原核表達(dá)產(chǎn)物，eae基因的上游引物為5‘-GGGAATTCCATATGATTACTCATGGTTGTTAT-3’，下游引物為5‘-CCGTCTCGAGTTCTACACAAACCGCATAG-3’，用稀釋液將待檢樣品1:200倍稀釋后加入板孔中，100uL/孔，用同樣的方法1:200倍稀釋陰、陽(yáng)性對(duì)照血清，陰、陽(yáng)性對(duì)照血清各設(shè)2孔，100uL/孔，另設(shè)一空白對(duì)照孔，空白對(duì)照孔加100ul待檢樣品稀釋液，輕輕振勻孔中樣品，37℃溫育1h；

2）甩凈孔中用稀釋液稀釋的待檢樣品和陰、陽(yáng)性對(duì)照血清以及待檢樣品稀釋液，用ddH₂O10倍稀釋的濃縮洗滌液洗滌5次，200uL/孔，每次5min，然后甩凈10倍稀釋的濃縮洗滌液，拍干；

3）將加了待檢樣品和陰、陽(yáng)性對(duì)照血清的所有孔以及空白對(duì)照孔加入用稀釋液1:5000倍稀釋的酶標(biāo)二抗100ul，37℃溫育1h；

4）洗滌，方法同步驟2）；

5）將加了待檢樣品和陰、陽(yáng)性對(duì)照血清的所有孔以及空白對(duì)照孔加入底物A液、底物B液、底物緩沖液配成的顯色液100ul，混勻，室溫避光顯色10分鐘。

6）將加了待檢樣品和陰、陽(yáng)性對(duì)照血清的所有孔以及空白對(duì)照孔加入終止液50ul，在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD₄₅₀。