[發明專利]甘草酸酶聯免疫檢測技術

無效

• 申請號: 201310545051.8
• 申請日: 2013-11-02
• 公開（公告）號: CN103613667A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發明（設計）人: 彭勵;宋孚洋;張東濤;李宏福;任樹勇;鄭麗萍
• 申請（專利權）人: 寧夏大學
• 主分類號: C07K16/40
• 分類號: C07K16/40;G01N33/577;G01N33/543
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及微量免疫檢測技術領域，具體涉及甘草酸酶聯免疫檢測技術。

背景技術

甘草酸的檢測方法主要有比色法、氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、薄層層析法(TCL)、毛細管電泳法(EC)等，但比色檢測法易受糖類等物質的干擾，誤差較大，只能測定可被顯色劑顯色的總皂苷類成分，色譜法固然靈敏度較高，樣品的預處理程序復雜，如氣相色譜需要將甘草酸轉化為甘草次酸，再進行酯化，檢測時間長、時效性差。此外要求操作人員技術性要求高，且需要昂貴的儀器設備，步驟繁瑣，難以實時監控，在甘草及其各類制品的快速鑒定方面存在諸多不足，不能滿足藥用甘草真偽快速鑒定及復方藥品或食品中快速大量的測定分析的需要。

發明內容

本發明的目的是提供甘草酸酶聯免疫檢測技術，它可對來源復雜的甘草及其相關產品進行快速、簡單、準確的檢測，判斷甘草原料藥中活性成分的有無。

為了解決背景技術所存在的問題，本發明是采用以下技術方案：它采用鼠源單克隆抗體技術，主要步驟包括：1、免疫原與包被原的合成與鑒定：采用活性酯發分別了免疫抗原和包被抗原，采用紫外掃描法檢測合成抗原的性質。

2、進行動物免疫：用合成的免疫原GA-KLH免疫Blab/c小鼠，通過3次加強免疫后斷尾取血，血清效價均大于1∶16000，經過融合，篩選出陽性細胞株，經過三次亞克隆化后陽性率達100％，獲得能穩定分泌甘草酸單克隆抗體的雜交細胞株，將其命名為3D6，經過7代培養，細胞的生長狀態良好。表明該細胞穩定性良好，可以用來穩定生產甘草酸單克隆抗體。

3、制備雜交瘤細胞：取準備好的脾細胞與骨髓瘤細胞融合后，應用間接ELISA和間接競爭ELISA方法進行篩選鑒定。陽性抑制滿足要求的細胞株，進行亞克隆，獲得大量雜交瘤細胞。

4、抗甘草酸單克隆抗體制備：取雌性小鼠5只，腹腔注射無菌液體石蠟0.5～1mL，7～10d后腹腔注射雜交瘤細胞1～5×106pfu/只。8～13d后待小鼠腹部明顯膨大后采集腹水。待3～4d腹水再次積聚后，同法收集腹水。

5、甘草酸單克隆抗體的初步鑒定：通過間接競爭ELISA測定抗體的抑制效果，甘草酸標準品用PBS按0、1、3、9、27、81μg/L稀釋成5個濃度梯度，用已建立的間接競爭ELISA所測A值計算各濃度的抑制率。

所述的動物免疫是單抗制備過程中的重要環節之一，其目的在于使B淋巴細胞在特異抗原刺激下分化、增殖，以利于細胞融合形成雜交細胞，并增加獲得分泌特異性抗體的雜交瘤的機會。

所述的動物免疫采用體內免疫法來進行免疫，因為可使抗原對脾細胞作用更迅速而充分。該方法適用于免疫原性強、來源充分的抗原，體內免疫法包括皮下注射、腹腔或靜脈注射，也采用足墊、皮內、滴鼻或點眼。最后一次加強免疫多采用腹腔或靜脈注射。

本發明的有益效果：可對來源復雜的甘草及其相關產品進行快速、簡單、準確的檢測，判斷甘草原料藥中活性成分的有無。

具體實施方式

本具體實施方式采用以下技術方案：它采用鼠源單克隆抗體技術，主要步驟包括：1、免疫原與包被原的合成與鑒定：采用活性酯發分別了免疫抗原和包被抗原，采用紫外掃描法檢測合成抗原的性質。

2、進行動物免疫：用合成的免疫原GA-KLH免疫Blab/c小鼠，通過3次加強免疫后斷尾取血，血清效價均大于1∶16000，經過融合，篩選出陽性細胞株，經過三次亞克隆化后陽性率達100％，獲得能穩定分泌甘草酸單克隆抗體的雜交細胞株，將其命名為3D6，經過7代培養，細胞的生長狀態良好。表明該細胞穩定性良好，可以用來穩定生產甘草酸單克隆抗體。

3、制備雜交瘤細胞：取準備好的脾細胞與骨髓瘤細胞融合后，應用間接ELISA和間接競爭ELISA方法進行篩選鑒定。陽性抑制滿足要求的細胞株，進行亞克隆，獲得大量雜交瘤細胞。

4、抗甘草酸單克隆抗體制備：取雌性小鼠5只，腹腔注射無菌液體石蠟0.5～1mL，7～10d后腹腔注射雜交瘤細胞1～5×106pfu/只。8～13d后待小鼠腹部明顯膨大后采集腹水。待3～4d腹水再次積聚后，同法收集腹水。

5、甘草酸單克隆抗體的初步鑒定：通過間接競爭ELISA測定抗體的抑制效果，甘草酸標準品用PBS按0、1、3、9、27、81μg/L稀釋成5個濃度梯度，用已建立的間接競爭ELISA所測A值計算各濃度的抑制率。

所述的動物免疫是單抗制備過程中的重要環節之一，其目的在于使B淋巴細胞在特異抗原刺激下分化、增殖，以利于細胞融合形成雜交細胞，并增加獲得分泌特異性抗體的雜交瘤的機會。