[發(fā)明專利]西洋參發(fā)狀根誘導(dǎo)及植株再生研究方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310545022.1
• 申請日: 2013-11-02
• 公開（公告）號: CN103614411A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王義;張美萍;宮秀杰;謝海云;孫春玉;蔣世翠;王康宇;楊廣順
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及西洋參發(fā)狀根誘導(dǎo)及植株再生研究方法，屬于作物生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

西洋參(Panax?quinque?folium?L.)American?Ginseng，是我國傳統(tǒng)名貴藥材，它屬于五加科人參屬多年生草本植物，又稱為美國參、花旗參、洋參、廣東參等名字，它最早是產(chǎn)于北美的原始森林，現(xiàn)在主產(chǎn)于法國、加拿大及美國，生長的最佳環(huán)境是在海拔2000公尺左右的丘陵地帶，并且屬于海洋性氣候，大概分布于北緯30°～47°、西經(jīng)67°～125°的大森林中。從20世紀(jì)80年代起我國就成功地大面積引種西洋參，經(jīng)過幾十年的努力，我國已經(jīng)發(fā)展成為繼美國、加拿大之后的世界第三大西洋參生產(chǎn)的國家和世界最大的消費(fèi)國家。

西洋參不論是地下還是及地上部分都含有多種生理活性成分，其中包括西洋參皂甙，它主要是三萜類化合物，與人參皂甙結(jié)構(gòu)基本相似。其它成分還包括黃酮類、揮發(fā)油、蛋白質(zhì)、、肽類、氨基酸、淄醇類、維生素、多糖、微量元素、核酸等。西洋參中最主要的有效成分是西洋參皂甙，它也是西洋參中生理活性最顯著的物質(zhì)，為此人們對西洋參皂苷進(jìn)行了大量的研究，先后從中分離出20多種單體皂苷。近十幾年來許多學(xué)者開始關(guān)注西洋參多糖的免疫功能。

西洋參為我國傳統(tǒng)珍貴的藥用植物，廣泛的應(yīng)用在人類保健和醫(yī)療上，并且市場對其需求量逐漸增加。由于西洋參對土壤條件要求十分嚴(yán)格且容易受氣候及病蟲害的影響，所以生產(chǎn)成本高、資源破壞嚴(yán)重，而且其生長周期特別長，以至于西洋參產(chǎn)量偏低，經(jīng)濟(jì)效益不好。因此要尋找一條有效的途徑改善西洋參的產(chǎn)量和質(zhì)量，提高其生產(chǎn)效益。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種西洋參發(fā)狀根誘導(dǎo)及植株再生研究方法，以便更好地解決植株再生面臨的根的分化難，或者生長能力弱和形成的根數(shù)量少難題。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下。

一種西洋參發(fā)狀根誘導(dǎo)及植株再生研究方法，包括以下步驟：

(1)外植體處理：(I)西洋參種子萌發(fā)及處理：經(jīng)過沙藏層積處理，已經(jīng)裂口的種子，播種到栽培盤中，遮蔭培養(yǎng)，待播種1～2周苗長出后，用0.1％升汞消毒6min，無菌水清洗4～5次。將其葉片、帶葉幼莖和莖段切成1.0cm的切段，接于MS固體培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)用作轉(zhuǎn)化的起始材料。(II)西洋參一年、二年生根的處理：將西洋參一年、二年生根表面用清水清洗干凈后，流水沖洗3～4h，用0.1％升汞消毒10min～20min后，無菌水洗5遍，切成0.2cm厚的薄片放在MS固體培養(yǎng)基上待用。

(2)菌種保存、活化及培養(yǎng)：發(fā)根農(nóng)桿菌的長期保存方法是將農(nóng)桿菌菌種溶于甘油中，于-20℃條件下保存，這種方法可以保存菌種幾年。短期保存的方法是將發(fā)根農(nóng)桿菌接種于YEB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，當(dāng)長出菌斑后，于4℃冰箱中保存，此種方法可以保存菌種數(shù)月。

無菌條件下，用接種針挑取保存的菌液，于YEB固體平板上劃線，28℃置于黑暗條件下培養(yǎng)，直到長出明顯的單菌落。然后挑取一個(gè)單菌落接種于50mL液體YEB培養(yǎng)基中，120r/min、28℃、暗條件下培養(yǎng)24h，此時(shí)YEB液體培養(yǎng)基由接種前的透明的紅棕色變成渾濁的淡黃色，證明細(xì)菌已正常長出。取1mL已活化的菌液加入50mL的YEB液體培養(yǎng)基中，120r/min，28℃暗條件下培養(yǎng)，活化菌液達(dá)到生長對數(shù)期時(shí)，此時(shí)的菌液就可以作為感染用。

(3)西洋參發(fā)狀根誘導(dǎo)條件的優(yōu)化：

(3a)不同菌種對西洋參發(fā)狀根誘導(dǎo)率的影響：選擇發(fā)根農(nóng)桿菌R1601、8196、A4、rolA四個(gè)菌種經(jīng)平板活化培養(yǎng)后接入YEB液體培養(yǎng)基中，待其菌液生長濃度達(dá)到OD₆₀₀=0.6時(shí)用于侵染用。2～3周苗齡的西洋參實(shí)生苗，選擇生長良好幼嫩的，將其葉片、帶葉幼莖和莖段切成1.0cm的切段，在無25±1℃搖床100～120r/min侵染10～30min，無菌條件下取出。滅菌濾紙吸干材料表面菌液，接于MS培養(yǎng)基上，考察不同菌種對西洋參發(fā)狀根誘導(dǎo)率的影響。

(3b)菌液濃度對西洋參發(fā)狀根誘導(dǎo)率的影響：制備好的R1601菌液用YEB液稀釋至OD₆₀₀值為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0，將西洋參實(shí)生苗外植體投入不同濃度的菌液中浸染15～30min，25±1℃搖床100～120r/min，然后取出用無菌濾紙吸干表面的菌液，在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)2d后，再轉(zhuǎn)接到MS共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，每隔7d換一次培養(yǎng)基。