[發明專利]西洋參發狀根誘導及植株再生研究方法

無效

• 申請號: 201310545022.1
• 申請日: 2013-11-02
• 公開（公告）號: CN103614411A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發明（設計）人: 王義;張美萍;宮秀杰;謝海云;孫春玉;蔣世翠;王康宇;楊廣順
• 申請（專利權）人: 吉林農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00
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• 代理人: 暫無信息

1.一種西洋參發狀根誘導及植株再生研究方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)外植體處理：(I)西洋參種子萌發及處理：經過沙藏層積處理，已經裂口的種子，播種到栽培盤中，遮蔭培養，待播種1～2周苗長出后，用0.1％升汞消毒6min，無菌水清洗4～5次；將其葉片、帶葉幼莖和莖段切成1.0cm的切段，接于MS固體培養基上預培養用作轉化的起始材料；(II)西洋參一年、二年生根的處理：將西洋參一年、二年生根表面用清水清洗干凈后，流水沖洗3～4h，用0.1％升汞消毒10min～20min后，無菌水洗5遍，切成0.2cm厚的薄片放在MS固體培養基上待用；

(2)菌種保存、活化及培養：發根農桿菌的長期保存方法是將農桿菌菌種溶于甘油中，于-20℃條件下保存；短期保存的方法是將發根農桿菌接種于YEB固體培養基上培養，當長出菌斑后，于4℃冰箱中保存；無菌條件下，用接種針挑取保存的菌液，于YEB固體平板上劃線，28℃置于黑暗條件下培養，直到長出明顯的單菌落；然后挑取一個單菌落接種于50mL液體YEB培養基中，120r/min、28℃、暗條件下培養24h，此時YEB液體培養基由接種前的透明的紅棕色變成渾濁的淡黃色，證明細菌已正常長出；取1mL已活化的菌液加入50mL的YEB液體培養基中，120r/min，28℃暗條件下培養，活化菌液達到生長對數期時，此時的菌液就可以作為感染用；

(3)西洋參發狀根誘導條件的優化：

(3a)不同菌種對西洋參發狀根誘導率的影響：選擇發根農桿菌R1601、8196、A4、rolA四個菌種經平板活化培養后接入YEB液體培養基中，待其菌液生長濃度達到OD₆₀₀=0.6時用于侵染用；2～3周苗齡的西洋參實生苗，選擇生長良好幼嫩的，將其葉片、帶葉幼莖和莖段切成1.0cm的切段，在無25±1℃搖床100～120r/min侵染10～30min，無菌條件下取出；滅菌濾紙吸干材料表面菌液，接于MS培養基上，考察不同菌種對西洋參發狀根誘導率的影響；

(3b)菌液濃度對西洋參發狀根誘導率的影響：制備好的R1601菌液用YEB液稀釋至OD₆₀₀值為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0，將西洋參實生苗外植體投入不同濃度的菌液中浸染15～30min，25±1℃搖床100～120r/min，然后取出用無菌濾紙吸干表面的菌液，在共培養基上培養2d后，再轉接到MS共培養培養基上，每隔7d換一次培養基；

(3c)AS與侵染時間對西洋參發狀根誘導率的影響：挑取的單菌落接種于添加AS的50mL?YEB液體培養基中活化，AS濃度選為0、100μmol/L振蕩培養，待其光密度值為0.6時將西洋參實生苗的組織段浸入，侵染時間選為10min、15min、20min、25min和30min：

(3d)不同外植體對西洋參發狀根誘導率的影響：選擇外植體為2～3周苗齡西洋參實生苗的葉片、莖段、葉柄和西洋參愈傷組織、一年、二年生西洋參根，選擇菌種為發根農桿菌R1601，考察西洋參外植體的選擇對發狀根誘導率的影響；其中葉片、莖段、葉柄為葉盤法，浸染時間為15～30min，西洋參愈傷組織、西洋參一年、二年生根為滴加法；

(3e)NAA濃度對西洋參發狀根誘導率的影響：在預培養的MS基本培養基中添加一定量的NAA有益于發狀根的誘導；以2～3周西洋參實生苗的葉柄為材料，MS基本培養基中添加NAA的濃度選擇分為0mg/L、2mg/L、4mg/L、6mg/L，比較發狀根誘導率以考察NAA最適濃度；

(3f)預培養時間對西洋參發狀根誘導率的影響：選擇MS+NAA2.0mg/L固體培養基為預培養基質，選擇2～3周西洋參實生苗的莖段為材料，預培養時間選為0h、12h、24h、48h、72h、96h，以考察預培養時間對西洋參發狀根誘導率；

(3g)NAA濃度對西洋參發狀根誘導率的影響：以2～3周西洋參實生苗的葉柄為材料，MS基本培養基中添加NAA的濃度選擇分為0mg/L、2mg/L、4mg/L、6mg/L，比較發狀根誘導率以考察NAA最適濃度；

(3h)共培養時間對西洋參發狀根誘導率的影響：選擇共培養時間為12h、24h、36h、48h，共培養培養基選為MS；以2～3周西洋參實生苗的莖段為材料，預培養培養基為MS+NAA2.0mg/L時間為48h，菌種為R1601，以考察基質與共培養時間對西洋參發狀根誘導率的影響；

(3i)頭孢霉素(Cef)濃度對抑菌和西洋參發狀根誘導率的影響：頭孢霉素(Cef)的濃度選擇為200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L，除菌基質選擇為MS基本固體培養基；綜合比較抑菌效果、污染率、獲得發根數三項指標，考察頭孢霉素(Cef)的最優濃度；

(4)西洋參發狀根的獲得與鑒定：

(4a)西洋參發根的獲得：

①外植體預培養：西洋參實生苗消毒后，將其葉片切成1.0cm×1.0cm的小塊，葉柄、和莖段切成1.0cm長的段，西洋參一年、二年生根流水沖洗去表面浮土，經升汞消毒后蒸餾水3～5遍沖洗干凈，視材料厚度切成0.2～0.5cm薄片，將以上所有材料接MS+NAA2mg/L培養基中黑暗條件下培養48h用于侵染；

②侵染與共培養：在超凈無菌工作臺上，將預培養的外植體材料，轉移到裝有準備好菌液的三角瓶中，封口后放在120r/min，黑暗條件下的搖床上感染10～30min，感染后的外植體用無菌濾紙吸干材料表面菌液，接種到MS固體培養基中，于黑暗、25℃條件下共培養48h；

③除菌培養：將共培養后的感染外植體材料用無菌水沖洗三遍，無菌濾紙吸干外植體材料表面的無菌水，將其轉接到含有頭孢霉素(Cef)500mg/L的MS固體培養基上培養，于黑暗、25℃條件下除菌培養；

(4b)西洋參愈傷與一年、二年生根發狀根的誘導：用微量移液槍吸取活化的發根農桿菌菌株8μL滴到已接到MS固體培養基的西洋參愈傷組織切面與西洋參根切片上；操作過程中避免菌液滴到MS固體培養基上，把滴加菌液的材料放在25℃，黑暗條件下的培養箱中培養；15d后除去褐化死亡的材料，將其余的材料轉移到新鮮的MS固體培養基上繼續培養；

(4c)PCR分子檢測：通過PCR方法對Ri質粒T_L-DNA的rolC基因檢測將進一步提供分子生物學的依據，具體過程如下：

①引物設計及合成：設計引物1和引物2：

引物1：5′-GATATATGCCAAATTTACACTAG-3′；

引物2：5′-GTTAACAAAGTAGGAAACAGG-3′；

利用以上兩個引物通過PCR擴增到T-DNA上rolC基因片段，預期長度是564bp；

②CTAB法提取西洋參發狀根總DNA；③提取發根農桿菌的Ri質粒；

④PCR循環參數：

⑤PCR反應體系：

超純水定容至25μl：

⑥瓊脂糖凝膠電泳，拍照；

(5)西洋參發狀根液體培養生長量與總皂苷含量的測定：發狀根液體培養采用MS液體培養基為基本培養基(3％蔗糖，pH值5.8～6.0)，將12條生長旺盛的約2cm的發狀根根尖接入裝有30mL?MS液體培養基中，溫度為24±1℃，搖床轉速100r/min，每隔3d取樣，測定發狀根干重及總皂苷的含量，測定一個月；所有數據為3瓶的平均值，重復兩次；

采用標準曲線法對發狀根中總皂苷的測定：標準曲線的繪制步驟為：①取Rg10.020g溶于甲醇中，定容為2mg/mL；②取Rg1對照品溶液30、60、90、120、150μL；③分別置于5支試管中(10mL，具塞)，甲醇定容為150μL，以相應試劑作對照；④將試管置于冰水浴中加5％香草醛醇溶液和72％硫酸搖勻，60℃恒溫水浴20min；⑤冰水浴15min后在755B分光光度儀544nm處檢測，以人參為標準品比色測定，根據標準曲線Y=503.29X+4.456，R²=0.9924求得樣品皂苷含量(％)；

發狀根中總皂苷的測定取液體培養的新鮮發狀根，蒸餾水沖洗后，用濾紙吸干發狀根表面的水分，稱量發狀根鮮重；然后于真空干燥箱中80℃下干燥至恒重，稱量，將干燥后的發狀根粉碎，放入三角瓶中，加入一定量的濃度為40％的乙醇溶劑，并將三角瓶口用封口膜密封；置于超聲發生器中進行分離提取，提取時間15min，超聲頻率為28KHz，提取兩次；在冰水浴中加5％香草醛醇溶液和72％H₂SO₄染色，60℃恒溫水浴10min，冰水浴15min，于544nm處測吸光度；

(6)西洋參發狀根再生體系的建立及條件優化：

(6a)西洋參發狀根愈傷組織的誘導：以西洋參發狀根為外植體，接到添加不同濃度，不同組合的2，4-D、BA、KT等生長調節劑的MS培養基上，其中蔗糖濃度為30g/L，瓊脂含量為6.5g/L，pH值是6.0(滅菌前)，培養基的滅菌壓力為0.1MP持續15～20min，放到不同光照條件下，光照周期為12h/d，溫度為24±1℃，兩周后統計愈傷組織發生率(發生愈傷組織的外植體數/外植體總數)分析不同生長調節劑與光照條件對愈傷組織誘導的影響，篩選最佳調節物質及濃度和光照條件；

(6b)西洋參發狀根胚狀體的發生：不同激素組合、濃度與光照對胚狀體發生和生長的影響分別取不同濃度及組合的2，4-D、KT、BA對培養物進行處理，分析各激素對胚狀體發生和生長的影響，篩選出胚狀體發生及生長的最優培養基配方；取黑暗、光照條件下培養，觀察光照條件對培養物的影響；光照由日光燈提供(約1200Lx)，光周期為12h/d。