[發明專利]含有鼠神經生長因子的表達載體及細胞有效

申請號：	201310544508.3	申請日：	2013-10-25
公開（公告）號：	CN103740754A	公開（公告）日：	2014-04-23
發明（設計）人：	饒春明;徐莉;李永紅;韓春梅;史新昌;陶磊	申請（專利權）人：	中國食品藥品檢定研究院
主分類號：	C12N15/85	分類號：	C12N15/85;C12N5/10;C12P21/02;C07K14/48;C07K1/18;C07K1/16
代理公司：	中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038	代理人：	劉向昕
地址：	100050***	國省代碼：	北京;11
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摘要：
搜索關鍵詞：	含有神經生長因子表達載體細胞
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及用于表達生長因子的表達載體和細胞，具體地，本發明涉及含有鼠神經生長因子的重組載體及重組細胞，本發明還涉及所述重組細胞的制備方法、鼠神經生長因子的純化方法以及所述重組載體或重組細胞用于制備鼠神經生長因子的用途。?

背景技術

神經生長因子，簡稱NGF，是一種分泌性蛋白，屬于神經營養因子家族，對維持神經元的存活，以及促進其生長具有重要作用。NGF最早在1952年由麗塔蒙特蘭奇發現，最初是由蛇毒中分離而得，隨后人們發現鼠頜下腺中富含NGF，且比活性很高，從鼠頜下腺中提取NGF工藝相對簡便，所以很長一段時期，人們將對NGF的研究集中在鼠頜下腺提取的NGF上。?

在鼠頜下腺中，NGF以7SNGF的形式存在，7SNGF有兩個阿爾法亞基，兩個伽馬亞基和兩個beta亞基組成的多聚體，在該多聚體中，beta亞基具備能夠有效結合NGF受體，且具備完全的NGF活性，由此beta亞基又被稱為鼠神經生長因子，簡稱mNGF。mNGF鏈內形成3對beta折疊，鏈內形成3對二硫鍵，由于這三對二硫鍵的形成，進行正確復性是比較困難的，另外在mNGF的前體鏈內有3個N糖基化位點，其中2個位于前肽部分，1個位于成熟肽部分，前肽的N糖基化有助于mNGF的折疊和分泌。?

鼠頜下腺提取的NGF，能夠有效治療外周神經損傷，持續性角膜缺損、角膜潰瘍、干燥性角膜結膜炎、白內障術后愈合、青光眼等，并成功治愈鼻咽癌放療引起的放射性顳葉壞死。針對正己烷中毒引起的神經損傷以及視神經損傷，mNGF功效顯著，目前已經有上市產品-注射用神經生長因子。?

由于市售mNGF都是鼠頜下腺中提取，可能存在動物源性病毒的污染，因此已有研究應用大腸桿菌^[1-4]、酵母^[5]、昆蟲細胞^[6-10]和哺乳動物細胞^[11]表達系統對mNGF進行表達。但大腸桿菌表達出的mNGF容易出現錯誤折疊，導致生物學活性降低，而利用酵母、昆蟲細胞和哺乳動物細胞表達NGF，也存在表達量低或活性偏低的問題。?

因此，本領域亟需能夠提高NGF表達量和/或維持NGF生物學活性的表?達系統。?

發明內容

本發明成功構建了鼠神經生長因子的真核表達載體，獲得了能夠穩定表達鼠神經生長因子的真核表達細胞，以及具有正確序列和較高活性的鼠神經生長因子，由此完成了本發明。?

本發明第一方面涉及重組載體，其含有鼠神經生長因子基因的核酸序列。?

在本發明的實施方案中，所述載體為適合鼠神經生長因子表達的載體，優選為真核表達載體，例如為pcDNA3.1、pEGFP-C1、pPIC9K；在本發明的具體實施方案中，所述載體為Freedom^TM?pCHO1.0。?

在本發明的實施方案中，將鼠神經生長因子基因的核酸序列插入載體的多克隆位點，即得到重組載體。?

在本發明的具體實施方案中，所述重組載體為pXL-mNGF。?

在本發明中的實施方案中，所述鼠神經生長因子基因的核酸序列為SEQ?ID?NO：3或SEQ?ID?NO：5所示的序列。其氨基酸序列分別對應于SEQ?ID?NO：4或SEQ?ID?NO：6所示的序列。?

在本發明的具體實施方案中，所述鼠神經生長因子基因的核酸序列為SEQ?ID?NO：3所示的序列。?

本發明第二方面涉及重組細胞，其含有本發明第一方面任一項的重組載體。?

在本發明的實施方案中，所述細胞為適合鼠神經生長因子表達的細胞，優選為真核細胞，例如為CHO細胞、293細胞、Hela細胞；在本發明的具體實施方案中，所述細胞為CHO細胞。?

根據本發明第二方面任一項的重組細胞，所述重組細胞為經過無血清培養基馴化培養后的細胞。?