[發明專利]含有鼠神經生長因子的表達載體及細胞有效
| 申請號： | 201310544508.3 | 申請日： | 2013-10-25 |
| 公開（公告）號： | CN103740754A | 公開（公告）日： | 2014-04-23 |
| 發明（設計）人： | 饒春明;徐莉;李永紅;韓春梅;史新昌;陶磊 | 申請（專利權）人： | 中國食品藥品檢定研究院 |
| 主分類號： | C12N15/85 | 分類號： | C12N15/85;C12N5/10;C12P21/02;C07K14/48;C07K1/18;C07K1/16 |
| 代理公司： | 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038 | 代理人： | 劉向昕 |
| 地址： | 100050*** | 國省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 含有 神經 生長因子 表達 載體 細胞 | ||
1.重組載體，其含有鼠神經生長因子基因的核酸序列；優選的，所述載體為FreedomTM?pCHO1.0；進一步優選的，所述重組載體為pXL-mNGF。?
2.重組細胞，其含有權利要求1的重組載體；優選的，所述細胞為CHO細胞。?
3.權利要求2的重組細胞，其為經過無血清培養基馴化培養后的細胞，優選地，所述無血清培養基為CD?FortiTM?CHO。?
4.權利要求2的重組細胞，其為經過氨甲喋呤和嘌呤霉素加壓篩選培養后的細胞。?
5.權利要求4的重組細胞，所述加壓篩選為兩個階段的加壓篩選，?
優選地，所述第一階段篩選中氨甲喋呤的濃度為100～200nM；第二階段篩選中氨甲喋呤的濃度為500～1000nM；?
優選地，所述第一階段篩選中嘌呤霉素的濃度為10～20μg/mL；第二階段篩選中嘌呤霉素的濃度為30～50μg/mL。?
6.權利要求2-5任一項的重組細胞，其保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCC?No.8305。?
7.鼠神經生長因子，其由權利要求1的重組載體或權利要求2-6任一項的重組細胞制備得到。?
8.權利要求1的重組載體或權利要求2-6任一項的重組細胞用于制備或生產鼠神經生長因子的用途。?
9.權利要求2-6任一項的重組細胞的制備方法，其包括以下步驟：?
（1）將權利要求1的重組載體轉染入CHO細胞中，在含有無血清培養基的細胞培養瓶中靜止培養10～14天（例如12天），所述無血清培養基中?氨甲喋呤的濃度為100～200nM，嘌呤霉素的濃度為10～20μg/mL；?
（2）將步驟（1）培養獲得的細胞轉移至搖瓶中搖動培養11～15天（例如第13天），每3～4天傳一代，培養基與步驟（1）相同；?
（3）適當增加細胞密度，繼續在含有無血清培養基的搖瓶中搖動培養18～25天，每3～4天傳一代，所述無血清培養基中氨甲喋呤的濃度為500～1000nM，嘌呤霉素的濃度為30～50μg/mL，即獲得權利要求2-6任一項的重組細胞；?
（4）任選地，還包括對所獲得的細胞進行單克隆篩選、以獲得更高表達量的細胞株的過程。?
10.鼠神經生長因子的制備方法，其包括權利要求9的制備方法，以及培養重組細胞和收獲細胞培養上清的步驟。?
11.鼠神經生長因子的純化方法，其包括以下步驟：?
1）培養表達鼠神經生長因子的重組細胞，收獲細胞培養上清；?
2）將細胞培養上清用離子交換層析進行純化，得到純化后的樣品；?
3）將步驟2）獲得的樣品用分子篩層析進行純化，得到純化的鼠神經生長因子；?
優選地，所述表達鼠神經生長因子的重組細胞為權利要求2-6任一項的重組細胞；進一步優選地，所述重組細胞是按照權利要求9所述的制備方法制備得到的。?
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