[發(fā)明專利]利用高通量測序精確測定線粒體DNA高頻和低頻突變的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310544351.4
• 申請日: 2013-11-06
• 公開（公告）號: CN103602735A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 倪挺;朱鈞;魏剛;諶婷
• 申請（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;盛志范

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因組學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用高通量測序（下一代測序、第二代測序、深度測序）技術(shù)測定真核生物線粒體DNA中高頻率及低頻率突變的方法。

背景技術(shù)

線粒體是細(xì)胞中提供能量的重要細(xì)胞器，在生物體能量轉(zhuǎn)換和新陳代謝中處于核心地位。人體細(xì)胞中線粒體DNA(脫氧核糖核酸)的突變或缺失會引起氧化磷酸化和能量供應(yīng)的異常，并進(jìn)而引起近150種人類疾病的發(fā)生，比如心血管疾病、糖尿病、耳聾、腫瘤、神經(jīng)退行性疾病及衰老等。

線粒體DNA是核外遺傳物質(zhì)，可以獨立編碼參與線粒體功能的一些重要蛋白。人類線粒體DNA為大小16571堿基的閉合雙鏈分子，編碼22種tRNA(轉(zhuǎn)運核糖核酸)、2種rRNA(核糖體RNA)和氧化磷酸化復(fù)合物中的13個亞基。線粒體DNA的變異包括大片段的插入或缺失，小片段的插入或缺失，點突變。這些變異既可以出現(xiàn)在編碼區(qū)，也可以出現(xiàn)在非編碼區(qū)。體內(nèi)活性氧(ROS,?reactive?oxygen?species)的異常增多是引起線粒體DNA堿基變異或點突變的主要原因。線粒體DNA上的某些區(qū)域由于受到活性氧引起的自由基的持續(xù)攻擊，產(chǎn)生點突變的頻率明顯高于其它區(qū)域，則稱之為突變熱點。比如亮氨酸轉(zhuǎn)運RNA基因的點突變就是線粒體DNA的一個病原學(xué)突變熱點。研究表明，一些編碼基因的點突變與某些特定的疾病有明顯的相關(guān)性。比如，在色素性視網(wǎng)膜炎、一些神經(jīng)疾病和Leigh綜合征中，均檢測到ATP合成酶中的亞基6上的點突變。并且，這些疾病的嚴(yán)重程度與該基因的點突變頻率密切相關(guān)。疾病發(fā)生早期線粒體DNA的低頻突變已經(jīng)發(fā)生，但目前尚無有效的高通量檢測方法。

線粒體基因組與核基因組在遺傳上的重要不同是：在一個細(xì)胞中，核基因組只有兩個拷貝，一個來自父親，一個來自母親；而線粒體基因組幾乎完全來自母親，并且有上千個拷貝（通常一個細(xì)胞有1000-2000個線粒體，一個線粒體有2-10個線粒體DNA拷貝）。這種拷貝數(shù)的不同也導(dǎo)致了在DNA突變檢測上的策略不同。對于基因組上某一位置的點突變只可能出現(xiàn)三種情況：均無突變，有一個拷貝發(fā)生突變，或者兩個拷貝均發(fā)生突變。而對于線粒體DNA來說，情況就要復(fù)雜的多，從一個線粒體DNA發(fā)生突變，到上千個線粒體DNA均發(fā)生突變，其中的突變頻率可以是0.1%~100%中的任何一個比例。而要精確檢測到這種突變頻率的變化，特別是低頻率(0.1%~10%)的點突變，用傳統(tǒng)的桑格測序(Sanger?sequencing)是無法進(jìn)行精確測定的。

隨著高通量測序技術(shù)（第二代測序、下一代測序、深度測序）的飛速發(fā)展，單個堿基的測序費用迅速下降，測序的覆蓋度也得以不斷加深，使得之前所不能實現(xiàn)的目標(biāo)有了新的可能。從理論上講，要檢測較低頻率的突變，比如說0.4%，則至少需要250倍的覆蓋度，加上每個點突變至少被檢測到兩次的標(biāo)準(zhǔn)以提高準(zhǔn)確性，則至少需要500倍的覆蓋度。深度測序的技術(shù)正好能夠滿足這樣的覆蓋度要求，因此使得檢測線粒體DNA的低頻突變成為可能。目前已有幾個方法測定線粒體的突變，比如從細(xì)胞中分離線粒體，再提取線粒體DNA并構(gòu)建文庫進(jìn)行深度測序。這種方法由于涉及到線粒體細(xì)胞器的分離，操作比較復(fù)雜繁瑣，尤其是在樣品多的時候工作量很大。另一種深度測序方法基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增，針對每個樣品需要分10個以上管子進(jìn)行PCR擴增，純化后連接再打斷，然后再構(gòu)建高通量測序文庫，并進(jìn)行深度測序。這種方法雖然能從總DNA中擴增線粒體DNA片段，但每個樣品需要分別做10個以上的不同引物對的擴增，還需要分別純化，耗時耗力，并且不同擴增片段之間的效率也不盡相同，因此在線粒體基因組上的覆蓋度均一性也較差。

為了克服以上方法的缺點，本發(fā)明提出了一種更簡單、更高效的線粒體DNA深度測序方法，并取名為mitoRCA-seq。這種方法通過設(shè)計一組線粒體DNA特異的引物，采用滾環(huán)復(fù)制（Rolling?Circle?Amplification,?RCA）從總DNA中富集線粒體DNA，并通過特定的限制性內(nèi)切酶進(jìn)一步富集線粒體DNA，然后構(gòu)建測序文庫并進(jìn)行高通量測序，并開發(fā)特定的數(shù)據(jù)分析流程，從而達(dá)到測定線粒體基因組中高頻率及低頻率點突變以及其它結(jié)構(gòu)變異的目的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種利用高通量測序技術(shù)測定真核生物線粒體DNA中高頻率及低頻率突變的方法。