[發(fā)明專利]一種可溶性淀粉底物特異性提高的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310542063.5
• 申請(qǐng)日: 2013-11-05
• 公開（公告）號(hào): CN103589699A
• 公開（公告）日: 2014-02-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳堅(jiān);堵國成;劉龍;李江華;韓瑞枝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/10
• 分類號(hào): C12N9/10;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/60;C12R1/19
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種可溶性淀粉底物特異性提高的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，尤其是一種可溶性淀粉底物特異性提高的短肽融合型環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶及制備方法，屬于遺傳工程和酶工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

L-抗壞血酸（L-AA，維生素C）是水溶性維生素，參與很多體內(nèi)的生理活動(dòng)，在保持和促進(jìn)人體健康中起到重要的作用，是人體無法自身合成的必需的營養(yǎng)元素。但L-AA極不穩(wěn)定，在空氣中易被氧化為脫氫抗壞血酸，破壞分子中的共軛體系，發(fā)生不可逆裂解反應(yīng)，特別是在空氣、光線、熱和金屬離子的存在下，反應(yīng)更迅速，使L-AA的生理活性減弱甚至消失，這使得它在應(yīng)用上受到很大的限制。因此，如何增強(qiáng)L-AA的穩(wěn)定性是目前國內(nèi)外學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界所關(guān)注的焦點(diǎn)問題。

2-O-α-D-吡喃型葡萄糖基-L-抗壞血酸（AA-2G）是L-AA的糖基衍生物，是將一個(gè)糖基以α-1,4-糖苷鍵連接于L-AA的C2位上。由于L-AA的C2位上有糖基掩蔽，不易發(fā)生氧化反應(yīng)，所以在水溶液中特別穩(wěn)定，并且AA-2G沒有直接還原性，有效地保護(hù)了L-AA的生物活性。所以AA-2G是迄今發(fā)現(xiàn)的穩(wěn)定性和性能最佳的L-AA替代品。

目前，AA-2G主要通過糖基轉(zhuǎn)移酶生物催化生成，其中環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（CGTase）是最常用的催化酶。通常以α-環(huán)糊精或β-環(huán)糊精為糖基供體，將葡萄糖基催化轉(zhuǎn)移到受體L-AA上。然而，若以α-環(huán)糊精為糖基供體，成本太高；若以β-環(huán)糊精為糖基供體，由于它的溶解度較低，酶促反應(yīng)效率受到較大限制。因此，選擇一種既便宜又易溶的糖基供體（如可溶性淀粉）將會(huì)大大減少AA-2G的生產(chǎn)成本，提高其利潤。但是，由于目前環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（CGTase）對(duì)可溶性淀粉的底物特異性（轉(zhuǎn)化率）較低，因此，通過分子改造CGTase技術(shù)提高其對(duì)可溶性淀粉的底物特異性，將推動(dòng)與L-AA糖基衍生物相關(guān)行業(yè)的快速發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種可溶性淀粉底物特異性提高的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，尤其是一種可溶性淀粉底物特異性提高的短肽融合型環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶；所述短肽融合型環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1或SEQ?ID?NO.2所示。

所述可溶性淀粉底物特異性提高的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，是以Genbank?AF047363.1所示的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列為出發(fā)序列，在該酶的N-末端分別融合了兩種不同的自組雙親短肽，構(gòu)建了兩種短肽融合型環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶：SAP1-CGTase和SAP2-CGTase。

所述環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶來源于軟化類芽孢桿菌(Peanibacillus?macerans)。

所述SAP1-CGTase是融合了序列如SEQ?ID?NO.3所示自主雙親短肽的CGTase，SAP1-CGTase的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；所述SAP2-CGTase是融合了序列如SEQ?ID?NO.4所示自主雙親短肽的CGTase，SAP2-CGTase的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；。

產(chǎn)所述短肽融合型環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的基因工程菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也為本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供一種產(chǎn)短肽融合型環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因工程菌的構(gòu)建方法，具體步驟如下：

1）采用化學(xué)全合成或PCR方法克隆編碼所述短肽融合型環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因；

2）將步驟1）獲得的短肽融合型環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因連接到大腸桿菌表達(dá)載體，得到重組表達(dá)載體；

3）將步驟2）獲得的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia?coli?BL21(DE3)得到基因工程菌。