[發(fā)明專利]一種可溶性淀粉底物特異性提高的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310542063.5
• 申請日: 2013-11-05
• 公開（公告）號: CN103589699A
• 公開（公告）日: 2014-02-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳堅;堵國成;劉龍;李江華;韓瑞枝
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/60;C12R1/19
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

1.一種可溶性淀粉底物特異性提高的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，是在環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶N-末端融合了自組雙親短肽，構(gòu)建短肽融合型環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，其特征在于，是以Genbank?AF047363.1所示的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列為出發(fā)序列，在該酶的N-末端融合自組雙親短肽，構(gòu)建短肽融合型環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，其特征在于，所述短肽融合型環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1或SEQ?ID?NO.2所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，其特征在于，所述自組雙親短肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3或SEQ?ID?NO.4所示。

5.攜帶編碼權(quán)利要求1所述環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的基因的質(zhì)粒、基因工程菌和轉(zhuǎn)基因細胞系。

6.一種產(chǎn)權(quán)利要求1所述酶的基因工程菌的構(gòu)建方法，具體步驟如下：

1）采用化學(xué)全合成或PCR方法克隆編碼所述短肽融合型環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因；

2）將步驟1）獲得的短肽融合型環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因連接到大腸桿菌表達載體，得到重組表達載體；

3）將步驟2）獲得的重組表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia?coli?BL21(DE3)得到基因工程菌。

7.一種應(yīng)用權(quán)利要求6所述方法構(gòu)建得到的大腸桿菌基因工程菌。

8.一種應(yīng)用權(quán)利要求7所述基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，以產(chǎn)短肽融合型環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的基因工程菌為生產(chǎn)菌株，活化后按4%接種量將種子發(fā)酵液接到含100μg/mL氨芐青霉素的TB液體培養(yǎng)基；在30℃搖床培養(yǎng)至OD₆₀₀=0.6，加入0.1mM終濃度的IPTG誘導(dǎo)胞外表達，并在25℃搖床繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵90h后，將發(fā)酵液于4℃、10000rpm離心20min除菌體，收集富含環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的上清液。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，向所述上清液中加入70%固體硫酸銨鹽析過夜，4℃、10000rpm離心20min，取沉淀物用含20mM磷酸鈉、0.5M氯化鈉、20mM咪唑、pH7.4的緩沖液A溶解，并在緩沖液A中透析過夜后，通過0.22μm膜過濾后制成上樣樣品；Ni親和柱用緩沖液A平衡后，將上樣樣品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分別用A、含20-480mM咪唑的緩沖液A、含480mM咪唑的緩沖液A的洗脫，流速1mL/min，檢測波長為280nm，分部收集含CGTase酶活的洗脫液；活力組分在50mM磷酸鈉緩沖液（pH=6）中透析過夜后，分別得到純化的融合酶SAP1-CGTase和SAP2-CGTase。

10.權(quán)利要求1所述環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶在生產(chǎn)2-O-α-D-吡喃型葡萄糖基-L-抗壞血酸中的應(yīng)用。