[發(fā)明專利]用于檢測(cè)NQO1基因多態(tài)性的引物、試劑盒及其在病理檢測(cè)上的應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310539817.1
• 申請(qǐng)日: 2013-11-04
• 公開（公告）號(hào): CN103667447A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鐘丹;薛群;陳奕磊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務(wù)所有限公司 33100
• 代理人: 黎雙華

1.用于檢測(cè)NQO1基因的C609T和C465T位點(diǎn)多態(tài)性的引物，其特征在于，所述引物包括從樣本核酸中擴(kuò)增NQO1基因第四外顯子C465T位點(diǎn)片段和第六外顯子C609T位點(diǎn)片段的特異性引物，其堿基序列為：

C465T-F?:?5'-CTAGCTTTACTCGGACCCACTC-3'

C465T-R:?5'-GCAACAAGAGGGAAGCTCCATC-3'

C609T-F:?5'-TCTTACTGAGAAGCCCAGACCAACT-3'

C609T-R:?5'-?CTCCAGGCGTTTCTTCCATCC-3'

以及對(duì)所獲得的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序的引物，其堿基序列為：

C465T-S:?5'-?GCATTCAGAACCATCCACCTAC?-3'

C609T-S:?5'-?TTCTGTGGCTTCCAAGTCTTAG?-3'。

2.如權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于，引物C465T-F和C609T-R的5'?端被生物素標(biāo)記。

3.如權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于，所述擴(kuò)增的反應(yīng)條件為94℃?2分鐘；98℃?10秒，60℃?20秒，68℃?20秒，35個(gè)循環(huán)；68℃?5分鐘。

4.一種檢測(cè)NQO1基因的C609T和C465T位點(diǎn)多態(tài)性的方法在病理檢測(cè)上的應(yīng)用，包括：

(1)提取樣本中的DNA；

(2)以步驟(1)中的DNA作為模板，使用一對(duì)引物C465T-F和C465T-R擴(kuò)增NQO1基因第四外顯子C465T位點(diǎn)片段，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1；使用一對(duì)引物C609T-F和C609T-R擴(kuò)增NQO1基因第六外顯子C609T位點(diǎn)片段，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2；

(3)取步驟(2)中的PCR?擴(kuò)增產(chǎn)物1和2進(jìn)行瓊脂糖電泳，檢測(cè)是否擴(kuò)增成功；

(4)若步驟(3)中擴(kuò)增成功，則利用焦磷酸測(cè)序引物C465T-S對(duì)步驟(2)中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1進(jìn)行測(cè)序，利用焦磷酸測(cè)序引物C609T-S對(duì)步驟(2)中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2進(jìn)行測(cè)序；

(5)根據(jù)步驟步驟(4)中的焦磷酸測(cè)序結(jié)果，確定NQO1基因的C465T和C609T位點(diǎn)的多態(tài)性；

(6)根據(jù)步驟(5)中的多態(tài)性結(jié)果，確定樣本的病理狀態(tài)；?

其特征在于，所述引物序列為：?

C465T-F:?5'-CTAGCTTTACTCGGACCCACTC-3'

C465T-R:?5'-GCAACAAGAGGGAAGCTCCATC-3'

C609T-F:?5'-TCTTACTGAGAAGCCCAGACCAACT-3'

C609T-R:?5'-?CTCCAGGCGTTTCTTCCATCC-3'

C465T-S:?5'-?GCATTCAGAACCATCCACCTAC?-3'

C609T-S:?5'-?TTCTGTGGCTTCCAAGTCTTAG?-3'。

5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述擴(kuò)增的反應(yīng)條件為94℃?2分鐘；98℃?10秒，60℃?20秒，68℃?20秒，35個(gè)循環(huán)；68℃?5分鐘。

6.用于檢測(cè)NQO1基因的C609T和C465T位點(diǎn)多態(tài)性的試劑盒，包括核酸提取試劑、PCR擴(kuò)增體系、焦磷酸測(cè)序試劑，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增體系包括用于擴(kuò)增基因NQO1第四外顯子C465T位點(diǎn)片段和第六外顯子C609T位點(diǎn)片段的特異性引物，其堿基序列為：

C465T-F?:?5'-CTAGCTTTACTCGGACCCACTC-3'

C465T-R:?5'-GCAACAAGAGGGAAGCTCCATC-3'

C609T-F:?5'-TCTTACTGAGAAGCCCAGACCAACT-3'

C609T-R:?5'-?CTCCAGGCGTTTCTTCCATCC-3'

所述焦磷酸測(cè)序試劑包括對(duì)所獲得的核酸擴(kuò)增片段進(jìn)行焦磷酸測(cè)序的引物，其堿基序列為：

C465T-S:?5'-?GCATTCAGAACCATCCACCTAC?-3'

C609T-S:?5'-?TTCTGTGGCTTCCAAGTCTTAG?-3'。

7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，引物C465T-F和C609T-R的5'端被生物素標(biāo)記。