[發明專利]用于檢測NQO1基因多態性的引物、試劑盒及其在病理檢測上的應用

無效

• 申請號: 201310539817.1
• 申請日: 2013-11-04
• 公開（公告）號: CN103667447A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 鐘丹;薛群;陳奕磊
• 申請（專利權）人: 武漢艾迪康醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 黎雙華

技術領域

本發明屬生命科學和生物技術領域，特別涉及用于醌氧化還原酶1基因NQO1*2(C609T)、NQO1*3(C465T)位點多態性檢測的引物、試劑盒和在病理檢測上的應用，采用焦磷酸測序技術，能對醌氧化還原酶1基因多態性進行檢測，特異性好，準確度高。

背景技術

醌氧化還原酶1基因（NADPH：quinone?oxidore-ductase1，NQO1）是由Ernster和Navazio于1958年首先報道的，最初被稱為DT-硫辛酰胺脫氫酶(DT-diaphorase)。它是絕大多數真核生物細胞中普遍存在的一種黃素蛋白酶,能夠解除許多天然和合成化合物的毒性,同時又能活化一些醌類抗腫瘤藥物,因而引起了廣泛關注。NQO1是一種可誘導的還原酶,酚類抗氧化劑、多環芳烴、偶氮染料、缺氧等外界環境因素均可以強烈地誘導NQO1表達。這種可誘導性表達使得NQO1可能在腫瘤預防和腫瘤治療上起重要作用。

20世紀90年代初，有研究發現NQO1cDNA609位點上存在C/T單核苷酸多態性(SNP)，可能改變酶的二級結構，使酶的活性降低，增加了氧自由基的生成。目前發現人的NQO1基因序列中，引起蛋白質編碼氨基酸序列改變的非同義編碼單核苷酸多態性有三個，其中包括位于第四外顯子的C465T和第六外顯子的C609T，分別引起所編碼的139位氨基酸由色氨酸（Trp）變為精氨酸（Arg），187位氨基酸由脯氨酸（Pro）變為絲氨酸（Ser）。這些氨基酸序列改變，可能導致了個體中酶NQO1活性的降低或缺失，減弱了NQO1對醌類化合物的解毒作用及改變腫瘤對特定原癌基因及抑癌基因功能的影響，從而使機體患腫瘤的可能性增加。

研究發現，酶NQO1具有2個野生型等位基因即野生純合子(C/C)的個體，NQO1酶的活力正常；而具有雜合子(C/T)的個體酶的活力降低，具有突變純合子(T/T)的個體NQO1酶的活力則完全消失。

目前對于NQO1C465T研究尚不很多。NQO1cDNA465位點上存在C/T單核苷酸多態性。不同人群NQO1465T等位基因頻率較低(0～0.05)。許多研究還發現，NQO1C609T基因多態性頻率在種族分布上有很大差異，基因型為(T/T)的純合子個體在中國和其他亞洲人種為18%～20%，大約為高加索人和美籍非洲人的4倍。

鑒于NQO1與腫瘤的發生、發展密切相關，其第六位外顯子（C609T）和第四位外顯子（C465T）具有非同義編碼單核苷酸多態性，可引起蛋白質編碼的堿基序列改變從而導致蛋白質功能的改變，進而影響腫瘤的發生發展。對其進行檢測將有助于進一步明確其遺傳背景在腫瘤發生中的作用，并為腫瘤個體化治療提供有益的指導。

在臨床實驗室中，目前檢醌氧化還原酶1基因NQO1*2(C609T)、NQO1*3(C465T)多態性的常用方法為限制性片段長度多態性（restriction?fragment?length?polymorphism，RELP）法。該技術為第一代DNA分子標記技術，利用限制性內切酶能識別DNA分子的特異序列，并在特定序列處切開DNA分子，即產生特征性的限制性片段，該方法的缺陷在于檢測靈敏度低且只能檢測大概型別，不能具體到突變比例。

本發明在原有的基礎上進行焦磷酸測序檢測，不僅能檢測到多態性位點的具體突變情況，也能根據圖譜辨別出突變比例，使檢測結果更加具體化。

發明內容

針對現有技術的缺陷，本發明除了利用兩對特異性的引物分別對醌氧化還原酶1基因NQO1的第四外顯子C465T位點片段和第六外顯子C609T位點片段進行常規PCR擴增外，還利用一對焦磷酸測序引物對PCR擴增片段進行正向測序和反向測序，不僅能夠檢測到多態性位點的具體突變情況，也能根據測序圖譜辨別出突變比例，使檢測結果更加具體化，從而能夠更好地為腫瘤個體化治療提供有益的指導。