[發明專利]用于桿狀病毒滴度測定的重組細胞系及其測定方法

有效

• 申請號: 201310538492.5
• 申請日: 2013-11-04
• 公開（公告）號: CN103571795A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發明（設計）人: 鄧菲;鄧馬平;張艷芳;王華林;胡志紅
• 申請（專利權）人: 中國科學院武漢病毒研究所
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C12Q1/70;C12Q1/02;C12R1/93
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙) 11371
• 代理人: 吳開磊

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體而言，涉及一種用于桿狀病毒滴度測定的重組細胞系及其測定方法。?

背景技術

桿狀病毒是一類DNA病毒，廣泛存在于自然界，主要感染鱗翅目、雙翅目和膜翅目昆蟲，其感染能夠導致昆蟲的液化死亡。隨著研究的深入，桿狀病毒已在生物殺蟲劑、真核表達、表面展示以及基因治療等方面得到越來越廣泛的應用。為使桿狀病毒能在應用中發揮最大的功效，就必須對桿狀病毒進行定量，即進行病毒滴度的測定。?

病毒滴度即病毒的毒力或毒價。在相關技術中，桿狀病毒滴度普遍采用終點稀釋法（endpoint?dilution）進行測定，指能使半數細胞出現病變的病毒稀釋度。該方法需通過觀察細胞病變來確定病毒的滴度。在測定過程中，可以有一些方法是采用Sf9昆蟲細胞為被感染細胞的。?

但是，由于Sf9昆蟲細胞是一種圓形的細胞，當被桿狀病毒感染后，其病變主要表現為細胞核膨大；而Sf9昆蟲細胞在細胞老化時也容易出現細胞核膨大的現象，因此，通過觀察很難判斷細胞核膨大的現象是否是由桿狀病毒所致，進而造成病毒滴度測定的結果不準確。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于桿狀病毒滴度測定的重組細胞系及其測定方法，以解決上述的問題。?

本發明的實施例提供了一種用于桿狀病毒滴度測定的重組細胞系，該重組細胞系保藏在中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為：CCTCC?No.C2013133；其保藏命名為：攜帶P基因的斜紋夜蛾卵巢細胞系Sf9-p，其保藏日期為2013年9月4日。?

在本發明的實施例中還提供了一種用于桿狀病毒滴度測定的重組細胞系，其構建方法包括以下步驟：?

構建報告質粒；所述報告質粒包括其中插入了編碼綠色熒光蛋白的報告基因、誘導所述報告基因表達的所述桿狀病毒的晚期基因的啟動子P基因；?

利用所述報告質粒轉染Sf9昆蟲細胞；?

將轉染后的所述Sf9昆蟲細胞用含有博來霉素以及胎牛血清的培養基篩選，得到單細胞克隆；?

將所述單細胞克隆繼續用含有博來霉素的培養基篩選，得到重組細胞系。?

本發明實施例提供的用于桿狀病毒滴度測定的重組細胞系，其整合了能夠編碼綠色熒光蛋白的報告基因以及誘導所述報告基因表達的所述桿狀病毒的晚期基因的啟動子P基因。重組細胞系在受到相應啟動子來源的病毒（桿狀病毒）的感染后，桿狀病毒早期基因的表達產物將激活位于報告基因上游的桿狀病毒的晚期基因的啟動子，從而啟動了報告基因的表達得到綠色熒光蛋白。在進行桿狀病毒滴度測定時，該重組細胞系通過觀察被感染細胞的熒光產生而非細胞病變（如，Sf9昆蟲細胞的細?胞核膨大）則可確定桿狀病毒的滴度。而感染后的發出熒光的細胞可通過常規的通過流式細胞儀等儀器進行定量，進而使得測定結果更為準確。?

本發明的實施例還提供了一種利用該重組細胞系測定桿狀病毒的滴度的方法，包括以下步驟：?

將重組細胞系制成細胞懸液；?

在待測的桿狀病毒液中加入所述細胞懸液，恒溫培養預定時間后通過觀察熒光情況進行病毒滴度計算，得到滴度。?

附圖說明

圖1示出了本發明實施例二提供的重組細胞系的構建方法流程圖；?

圖2示出了本發明實施例二提供的重組細胞系測定桿狀病毒的滴度的方法流程圖；?

圖3示出了本發明實施例一和實施例提供的報告質粒的結構示意圖。?

具體實施方式

下面通過具體的實施例子并結合附圖對本發明做進一步的詳細描述。?

實施例一?

在本發明的實施例中提供了一種用于桿狀病毒滴度測定的重組細胞系的構建方法，包括以下步驟：?

構建報告質粒；?

其中，所述報告質粒包括其中插入了編碼綠色熒光蛋白的報告基因、誘導所述報告基因表達的所述桿狀病毒的晚期基因的啟動子P基因；?

利用所述報告質粒轉染Sf9昆蟲細胞；?

將轉染后的所述Sf9昆蟲細胞用含有博來霉素以及胎牛血清的培養基篩選，得到單細胞克隆；?

將所述單細胞克隆繼續用含有博來霉素的培養基篩選，得到重組細胞系。?